论文部分内容阅读
恶性脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一,化疗药物耐受是化疗低效的重要原因。基因治疗协同化疗实现化疗增敏是当前研究的热点。本项目组将基因治疗与先进材料技术相结合,以PAMAM树形大分子为载体,实现靶向miR-21反义寡核苷酸(as-miR-21)与5-氟尿嘧啶(5-FU)及紫杉醇(taxol)的体外肿瘤细胞内共传递,共同抑制人脑胶质瘤细胞的生长。凝胶电泳法研究PAMAM与as-miR-21配比对基因负载的影响,证明当N/P大于16:1时,as-miR-21与PAMAM完全结合,且复合物呈荷正电性。透射电镜研究了PAMAM/as-miR-21复合物的形貌,粒径在60~80nm,适合于体内外基因转染的要求。以U251胶质瘤细胞为模型,研究PAMAM载体对as-miR-21的转染效果,并与oligofectamin进行了对比。动态荧光显微镜观察发现PAMAM组的转染效果显著优于oligofectamin组;流式细胞仪验证了上述结果,PAMAM组转染后4小时达到最高转染效率,并且从转染3-7h都可以保持较高的转染效率。以U251胶质瘤细胞为模型,研究PAMAM介导5-FU联合as-miR-21的抑瘤作用。透析法合成5-FU/PAMAM,其药物包封率为(66.21士4.11)%,平均载药量为(31.77士0.73)%。药物释放行为研究表明,PAMAM具有很好的缓释作用。凝胶电泳表明载药后对基因配比没有明显影响;MTT显示联合治疗组细胞增殖率显著降低,流式细胞仪检测细胞凋亡比例显著升高,transwell法检测细胞迁移能力显著下降。证明PAMAM介导5-FU联合as-miR-21对胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,是治疗胶质瘤细胞的新策略。以U251和LN229胶质瘤细胞为模型,研究PAMAM介导miR-21抑制剂联合紫杉醇的抑瘤作用。MTT法表明联合治疗组细胞IC50显著降低,紫杉醇在U251的IC50值从400nmo/L降低到60nmo/L;在LN229中的IC50值从820nmo/L降低到160nmo/L。MTT结果表明联合治疗组细胞增殖率显著降低,流式细胞仪表明细胞凋亡比例显著升高,细胞周期的G0/G1期和S期均被阻滞;transwell法检测联合治疗组细胞体外侵袭能力显著下降。Western blot结果表明EGFR、p-AKT、STAT3、p-STAT3、BcL-2、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均有明显的下调,而PTEN和Caspase-3的表达则明显上调。证明PAMAM介导miR-21抑制剂联合紫杉醇化疗对胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,可以成为治疗胶质瘤细胞的新方法。