糖蛋白作为生物体的主要组成和功能物质,参与了所有的生命活动,具有重要的生物学功能,其中糖基化发挥着至关重要的作用。蛋白质的糖基化类型主要有两种:N-糖基化和O-糖基化,相应的糖蛋白寡糖也分为N-链寡糖和O-链寡糖。目前对于这两种蛋白寡糖已经有了比较普遍应用的分析方法,但无论是N-还是O-链寡糖,它们的结构分析方法都存在着不足。本文即是针对目前N-链和O-链寡糖结构分析方法所存在的问题对其进行优化,并利用优化后的方法对食物源中的两种寡糖进行结构分析上的应用。1.食物源N-链寡糖结构分析方法的优化和应用从糖蛋白上将糖链解离下来是进行糖链分析的首要步骤,而目前广泛使用的解离N-链寡糖的工具是PNGaseF和PNGaseA酶,但两种酶皆有不足之处。本实验室前期从细菌Terriglobus roseus中发现了 一种编码新型N-糖酰胺酶PNGaseH+的基因,重组表达的PNGaseH+有如下优点:可以作用于所有类型的N-糖链;无论是糖肽还是糖蛋白都可以作为有效底物;本身不是糖蛋白,不会对分析结果产生干扰。以上述PNGaseH+为基础,本实验通过优化反应试剂和流程,建立了酶解释放糖蛋白更加快速、便捷的方法。由于PNGaseH+在酸性条件下具有高活性,因此在利用酸性反应液进行糖链解离后,用相同反应液直接进行2-氨基苯甲酰胺(2-AB)的荧光标记,大大缩短了样品处理、反应与检测时间。实验以辣根过氧化物酶为模型糖蛋白对酸性反应液的浓度与反应时间进行了优化,结果表明在1 mol/L乙酸条件下,反应两个小时可以完全酶解释放糖蛋白上的N-链寡糖。与传统方法相比,本方法不会造成样品的损失。通过对不同的底物浓度进行分析验证了方法的稳定性与实用性。利用这种新型方法使用高效液相对各种植物来源的糖蛋白进行分析,结果表明,所有样品处理步骤不超过四小时,不需要长时间的纯化和真空干燥步骤。与MALDI-ToF-MS质谱联用后,进一步成功地对水果、蔬菜和蘑菇中的糖蛋白N-链寡糖结构进行了详细解析,从而找出了不同种类食物中所含有的N-链寡糖的种类和结构特点。2.食物源O-链寡糖的结构分析方法优化和应用相比于N-链寡糖,O-链寡糖的结构更为复杂,且迄今为止没有一种像PNGase类的酶可以将所有O-链寡糖从蛋白质分子上解离下来,目前可供选择的只有化学法。其中,β-消除法以氨水为介质、反应条件较温和、解离O-链寡糖效果较好,但该方法存在着糖链降解现象。本实验在已有方法的基础上,从糖链解离效率最大化和剥皮反应最小化两个方面入手,对该方法中的反应条件、反应时间和反应温度等因素进行了优化,结果表明:当反应温度为60 ℃,反应时间为16 h时,在保证O-糖链有效峰比例尽量大的情况下降解反应程度最小。本文利用优化的β-消除法,结合超高压液相技术对乳中具有重要生物学作用的糖蛋白O-链寡糖进行了结构分析,最终得到了较好的液相色谱图谱和较为详细的糖链结构。