大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。全国每年近千万人的烧伤病人,近万人严重烧伤,其中约10%的严重烧伤病人由于缺乏皮源尚无法挽救其性命。严重烧伤获救的病人由于无汗腺功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤功能,严重影响病人的生活质量。汗腺是人体皮肤组织中重要的功能性附属器,汗腺可分为顶泌汗腺即大汗腺,和外泌汗腺即小汗腺。一般所说的汗腺是外泌汗腺,在调节体温、分泌汗液及排出人体部分代谢废物的过程中发挥重要的作用。外泌汗腺是单管状腺,分为分泌部和导管部,分泌部位于真皮层或皮下组织内,是盘曲成团的小管,而导管部开口于表皮层,连接分泌部和外界环境。汗腺的发育开始于胚胎时期14-16周,至24周基本成熟,出生之后不会有新生的汗腺组织形成。皮肤组织修复和功能重建在国内和国际上都是生物医学领域研究的核心和热点。轻度烧伤时,汗腺的导管处细胞可以其深部未受损的部分为模版从而重建汗腺被损坏的部分;但全层皮肤大面积深度烧伤时,由于汗腺组织被毁,则不能依赖细胞的分裂、增殖与终末分化来自我更新而重建其复杂结构。至今尚无有效的方法体外扩增人汗腺细胞,对其生物学特性知之甚少。同时,干细胞可以定向分化为并构建具有覆盖保护能力的表皮层组织;也有研究表明干细胞可以定向分化为具有汗腺细胞表型的汗腺样细胞,但是对于汗腺组织的功能性重建还未见报道,且干细胞分化为汗腺样细胞的具体机制尚待探讨。本研究皆在建立人外泌汗腺细胞体外分离和培养方法,并分析其生物学特性,在此基础上,通过构建人汗腺细胞来源的i PS细胞,根据i PS细胞具有来源细胞的记忆性这一特性,开展汗腺细胞来源的i PS细胞分化为汗腺样细胞的研究,探讨其分化的关键分子机制,为其他类型干细胞分化为汗腺样细胞提供理论基础,使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能,提高大面积烧伤病人救治后的临床疗效,具有研究的创新性和潜在的应用价值。第一部分人外泌汗腺细胞体外分离和培养及其生物学特性的鉴定目的:建立体外分离、提取、培养和纯化人外泌汗腺细胞的方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法:将人皮肤样本除去脂肪和结缔组织,剪成1mm2的小块,用分散酶于4℃消化18小时,第二天取出后用PBS漂洗。用镊子将真皮层与表皮层轻轻分离,真皮层用剪刀剪碎,加入IV型胶原酶于37℃消化1小时,然后在倒置显微镜下使用移液枪将游离的汗腺组织吸出。在6cm的培养皿中先预先铺一层鼠尾胶原,将汗腺贴于预铺了胶原的6cm细胞培养皿中,一个小时后加入汗腺细胞培养基,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。2-3d后,汗腺细胞从汗腺组织中长出。倒置显微镜观察人外泌汗腺细胞形态;免疫组化方法对比不同部位来源皮肤汗腺数量的多少;透射电镜观察皮肤样本汗腺细胞的细胞器结构;PCR分析汗腺细胞胚胎干细胞标记和角质化细胞标记;免疫荧光染色技术检测体外培养的汗腺细胞的标志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表达。结果:(1)光学倒置显微镜下观察人外泌汗腺,游离出来的汗腺组织可以观察到盘曲成球的分泌部和较直的导管部;贴壁培养后可见汗腺上皮细胞从汗腺组织中生长出来,呈典型的上皮细胞样,排列紧密,类似铺石路状,细胞边界明显,核清晰,具有一定的增殖能力;(2)免疫组化结果显示,成人手掌部、成人头颈部和成人胸腹部的皮肤处存在的汗腺数量较少,而手术切除的婴幼儿多指样本皮肤中存在有大量的汗腺;(3)透射电镜结果显示,皮肤中汗腺导管处由两层细胞构成,且存在有张力原纤维,汗腺腺体分泌部由两类细胞构成,分别是构成管腔的细胞和肌上皮细胞;(4)PCR结果显示,体外培养的汗腺细胞,不表达胚胎干细胞的干性指标Oct-4、Sox-2和Nanog,表达增殖相关基因Klf-4和c-Myc,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞指标K14、K8、K18和K19;(5)免疫荧光染色结果显示,体外分离培养的人汗腺细胞表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞标记K14、K8和K18。结论:成功从手术切除的婴幼儿皮肤样本中分离提取出大量的汗腺组织,满足实验研究的需要;体外分离培养的汗腺细胞具有一定的增殖能力,能传代培养2~3代;对体外培养的汗腺细胞生物学特性进行鉴定,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞标记K14、K8和K18,具有上皮细胞的特性,为进一步研究汗腺细胞奠定基础。第二部分人外泌汗腺细胞来源i PS细胞的构建以及定向分化为汗腺样细胞的研究目的:构建人外泌汗腺细胞来源的i PS细胞,并对其生物学特性进行鉴定;定向诱导人外泌汗腺细胞来源的i PS细胞分化为汗腺样细胞,并对其生物学特性及功能性进行鉴定。方法:取体外培养10天后的汗腺细胞,以1×105个/皿的密度接种于6cm细胞培养皿中,加入4种含有胚胎干细胞的转录因子基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒,24小时后移除含有慢病毒的培养基,PBS冲洗,加入新鲜的汗腺细胞完全培养基;2-3天后,消化细胞接种到铺有滋养层细胞的6cm细胞培养皿中,更换胚胎干细胞培养基,培养约10天后,挑选克隆和细胞形态与胚胎干细胞相似的克隆,接种于铺有滋养层细胞的24孔板中。培养约10天后,再次挑选克隆和细胞形态与胚胎干细胞相似的克隆,接种于铺有滋养层细胞的6孔板中继续培养。光学显微镜观察细胞形态;RT-PCR,免疫荧光染色检测诱导后的细胞生物学特性;细胞连续培养计数分析汗腺细胞来源i PS细胞的增殖能力;体外培养的人汗腺细胞经过5-7天的培养,更换培养基为KGM2培养基,收集培养过人汗腺细胞的KGM2培养基,用0.22μm的滤器过滤,收集到的培养基为CM;取稳定培养的人汗腺细胞来源i PS细胞,以2×105个/孔的密度接种于6孔板中,24小时后,待i PS细胞贴壁后,添加汗腺细胞诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基:CM=1:1,额外添加50ng/ml EGF);然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基;待诱导后的细胞生长至汇合率为70%,对细胞消化传代,按1传4的比例接种细胞至新的培养皿中,诱导分化21天后得到汗腺样细胞;光学显微镜观察其细胞形态;Realtime-PCR分析其基因表达情况;流式细胞仪检测汗腺相关蛋白表达;免疫荧光染色检测汗腺相关蛋白表达;电镜技术观察细胞内部结构;3D组织培养方法检测分化后的汗腺样细胞形成汗腺样结构的能力,并对形成的汗腺样结构进行免疫荧光染色检测。结果:(1)光学显微镜下观察构建的人汗腺细胞来源i PS细胞,呈克隆样生长,细胞边界明显,核质比较高,有形成类胚体的能力,与人胚胎干细胞相似;(2)PCR结果表明人汗腺细胞来源i PS细胞表达胚胎干细胞指标Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc和Nanong,同时也表达汗腺相关指标K14和CD24;(3)免疫荧光染色结果显示人汗腺细胞来源i PS细胞表达胚胎干细胞标志物Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81;(4)细胞连续培养计数结果表明人汗腺细胞来源i PS细胞具有良好的增殖能力;(5)光学显微镜下观察,由汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化得到的汗腺样细胞,细胞变大,成上皮细胞样生长,核质比变小;而人汗腺细胞,细胞较大,具有明显的上皮细胞形态,呈铺路石状生长,细胞排列整齐。(6)Realtime-PCR结果显示,汗腺细胞来源i PS细胞在诱导的过程中,在m RNA水平上逐渐表达汗腺细胞指标EDA、EDAR、K8和CEA,且在分化的过程中逐渐接近汗腺细胞。(7)流式细胞仪技术检测结果表明,诱导后的细胞表达汗腺相关指标ED A大约63%,ED AR大约65%,K 8大约76%,C EA大约56%。(8)透射电镜结果 表明,诱导后得到的汗腺样细胞具有人汗腺细胞有的微绒毛,而汗腺细胞来源i PS细胞则没有微绒毛;(9)3D组织培养结果显示,汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化的汗腺样细胞能够在胶中形成汗腺管状结构,可见管状结构横截面以及管腔,可观察到诱导后的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程,汗腺样细胞在胶中增殖成团,中间的细胞逐渐凋亡,形成管腔;(10)免疫荧光染色的结果 表明,汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构表达部分汗腺相关基因。结论:利用i PS技术成功构建人汗腺细胞来源i PS细胞,并对其生物学特性进行了检测分析,与人胚胎干细胞相似;定向诱导人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞,光学显微镜、Realtime-PCR、免疫荧光染色、透射电镜及3D组织培养结果显示,人汗腺细胞来源i PS细胞能分化为汗腺样细胞,并且具有形成汗腺样结构的能力。第三部分干细胞汗腺分化机制的探讨目的:在建立使用条件培养基(Condition media,CM)可诱导人汗腺来源i PS细胞分化为汗腺样细胞的基础上,分析CM中可能起关键作用的分子,为干细胞汗腺分化寻找合适的培养体系,为研究干细胞汗腺分化机制的研究提供理论依据。方法:取2×104的人汗腺来源i PS细胞(SG-i PS)铺于6孔板一孔中,加入诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基:CM=1:1,额外添加50ng/ml EGF),分别取诱导7天,14天和21天的样本,利用Realtime-PCR方法检测分析不同分化时间点的汗腺样细胞的基因表达情况;针对BMP4和HGF信号通路,利用Realtime-PCR方法和免疫荧光染色的方法分析在分化过程中BMP4和HGF可能的来源,比较人汗腺细胞(SG)、人汗腺细胞培养中存在的成纤维细胞(SG-Fib)以及SG-Fib脱离SG环境培养2周的成纤维细胞(Fib);Western blot和ELISA检测CM中HGF和BMP4的存在;在SG-i PS分化到汗腺样细胞的过程中,加入HGF和BMP4拮抗剂,分化21天后Realtime-PCR方法检测汗腺相关基因的表达;在SG-i PS分化到汗腺样细胞的过程中额外添加HGF和BMP4,分化21天后Realtime-PCR方法检测汗腺相关基因的表达;结果:(1)Realtime-PCR方法检测结果显示,汗腺相关基因EDA、EDAR和LEF1的表达在分化过程中呈上升趋势,在第14天达到峰值,分化21天后表达水平接近正常汗腺细胞,说明EDA,EDAR和Left1在汗腺分化过程中发挥一定作用;进一步检测其上游基因表达,包括MAPK通路和Wnt通路中相关基因,发现ERK和β-catenin的表达呈现相关性。BMP4,HGF,FGF10是胞外与MAPK和Wnt通路有相关作用的分子,检测其受体在细胞膜上的表达,发现BMP4受体BMPR1和BMPR2及HGF受体HGFR在分化过程中均有表达,而FGF10受体FGFR2则没有表达;Realtime-PCR方法检测BMP4和HGF在分化过程中的来源结果发现,在细胞中,BMP4主要由汗腺细胞来源的成纤维细胞分泌,汗腺细胞也有不同程度的分泌,而HGF则主要由汗腺来源的成纤维细胞分泌,免疫荧光染色的结果也证明了这一结果;在汗腺来源CM中,Western blot和ELISA结果显示HGF和BMP4均有存在,这说明在CM中存在对汗腺分化具有作用的HGF和BMP4;(2)在分化过程中加入BMP4和HGF拮抗剂后,汗腺相关基因EDA、EDAR、CEA和K8均有不同程度的下降,加入HGF拮抗剂的基因表达下降的比加入BMP4拮抗剂的明显;在分化过程中额外加入BMP4和HGF重组蛋白取代CM中可能存在的未知分子,汗腺相关基因EDA、EDAR、CEA和K8表现出一定的相关性,但还不如汗腺诱导培养基诱导的效果明显。结论:由人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞的过程中,从CM中寻找到两个相关因子,HGF和BMP4在人汗腺来源i PS细胞分化为汗腺样细胞中起关键作用,得出两条可能的汗腺分化的作用途径:HGF和BMP4通路。HGF与细胞膜上的受体c-Met结合,促进细胞基质中β-catenin表达上升,β-catenin进入细胞核内与Lef1作用,激活EDA/EDAR信号通路,从而启动汗腺分化;BMP4与细胞膜上的受体BMPR1和BMPR2结合,激活MAPK通路中的其中一条ERK通路,随后ERK与细胞核中的Lef1作用激活EDA/EDAR信号通路,从而启动汗腺分化。综上所述,本课题成功分离提取了人外泌汗腺,建立了体外培养人外泌汗腺细胞的方法,并用体外培养的人外泌汗腺细胞成功构建的人汗腺细胞来源i PS细胞,对其生物学特性进行了鉴定,并在此基础上定向诱导人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞,对得到的汗腺样细胞进行了生物学特性及功能性鉴定,在诱导分化的过程中寻找到了两个可能的关键分子HGF和BMP4,建立了合适的干细胞汗腺分化培养体系,不仅为研究干细胞汗腺分化机制的研究提供有价值的理论依据,也为汗腺的功能性重建开拓新的途径,具有潜在的应用价值。