高通量药物筛选是药物发现早期的重要工具,近年来发展迅速,人们已开发出了各种高通量药物筛选方法,报告基因方法是重要的方法之一。 D1样受体包括D1和D5,是Gs偶联受体,腺苷环化酶关联的,它们在药理学上性质相似,难以在药理学上区分,所以笔者同时筛选这两个受体的激动剂。D1样受体激动剂是治疗parkinson病、改善记忆、治疗药物成瘾等的重要药物。Klotho是一个衰老抑制基因,编码一种β-糖苷酶,它的突变和表达不足会引起衰老及相关病症,将klotho基因转入到其表达不足的动物模型上,可以改善衰老相关病症。所以体内调节klotho基因的表达对防治衰老相关疾病,及研究klotho基因的功能都有具有重要意义。本课题的主要研究内容及结果如下:(1)开发了一个报告基因系统,将6个CRE响应元件与一个人工合成的TATATA盒相连,控制报告基因(萤火虫荧光素酶,Luciferase)的表达,能敏感地响应细胞中cAMP水平的变化,这种报告基因系统(6CRE /TA/ Luci)适合于Gs和Gi偶联受体的药物筛选。(2)将这样的报告基因系统6CRE /TA/ Luci与D1样受体共同转入CHO细胞,建成稳定的细胞株(D5/CRE /TA/ Luci/CHO和D1/CRE /TA/ Luci/CHO)。用这个细胞株从天然提取物中筛选D1样受体的激动剂,通过对筛选系统的优化,这个系统符合高通量药物筛选的要求。筛选时,将这样的细胞接种于标准的96孔板中,培养过夜后,再与天然提取物共孵8 h,检测萤火虫荧光素酶的活性,筛选能激活萤火虫荧光素酶表达的天然提取物。有多个天然提取物有生物活性,通过用对照细胞株CRE /TA/ Luci/CHO排除假阳性,最终确定一个动物盔甲提取物(SBG492)含有D1样受体的激动剂。(3)克隆D5的同时,还克隆到了D5家族的一个新成员(D5B),D5B有 98%与D5同源,95%与D5的假基因同源,它介于D5与D5的假基因之间,在与D5不同的地方,则与D5的假基因相同,与D5假基因不同的地方则与D5相同,编码的蛋白比D5多一个氨基酸。D5B属于Gs偶联受体,与D5的不同主要在COOH端,对多巴胺的亲和性比D5大一倍。(4)将klotho基因的启动子与一个报告基因(萤火虫荧光素酶,Luciferase)相连,转入HEK293细胞,建立了稳定的细胞株,这种细胞用终浓度0.006 %的H2O2处理,建成了衰老模型,在这种细胞中,klotho启动子受到抑制,萤火虫荧光素酶的活性较低。用这种细胞模型筛选能上调报告基因活性的天然提取物。通<WP=6>过优化,这种细胞模型能以高通量形式筛选药物。将“衰老”细胞与天然提取物共孵6 h后,检测萤火虫荧光素酶的活性,筛选能提高荧光素酶活性的天然提取物,有多个天然提取物能激活klotho启动子,上调报告基因的表达。(5)SBG530是一种草本植物的提取物,对klotho启动子有调控作用,笔者采用生物活性导向分离技术,对SBG530进行了活性物质的分离。SBG530水提物经浓缩、醇沉淀、再浓缩,和正已烷萃取,然后在硅胶柱上,用正已烷与甲酸甲酯混合溶剂,从5:1到1:1进行梯度洗脱,得到了能上调klotho启动子活性的一个单一的小分子化合物。总之, 我们采用报告基因技术,建立了可行的高通量筛选模型,有效地筛选到了D1样受体的激动剂和klotho启动子激活。涉及的两个药靶都是与衰老相关疾病有关。开发了一个报告基因系统;克隆到一个D5受体家族的一个新成员(D5B),并初步研究了其功能;对能激活klotho启动子的天然提取物SBG530进行了生物活性导向分离。