板蓝根作为传统中药,来源于十字花科植物蒋蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根。性苦,寒。具有清热解毒,凉血利咽的功效。现如今板蓝根在临床上常用于病毒性疾病及细菌感染性疾病,尤其在抗病毒方面疗效确切,是较为广谱的天然抗病毒药物。课题组前期研究表明,板蓝根抗病毒作用存在多成分、多靶点的协同效应,但具体是哪些组分,通过什么样的机制发挥作用,没有开展深入研究。前期研究发现,板蓝根抗病毒有效部位主要为总生物碱、总木脂素和总有机酸,抗病毒活性与免疫调节作用密切相关,本文以板蓝根抗病毒的有效部位为主要研究对象,围绕其对于免疫信号通路的干预作用,研究抗病毒协同效应的作用机制,具体内容包括以下几个方面:(1)板蓝根各有效部位的制备工艺研究基于正交设计分别对板蓝根总生物碱、总木脂素和总有机酸三个部位的提取工艺进行了考察,优选出板蓝根三个部位的最优提取工艺。其中总生物碱部位经过大孔树脂分离富集,采用三种以上的生物碱沉淀试剂联合检测,选择性收集三种生物碱沉淀试剂同时呈阳性的流份,然后以吲哚-3-甲醛为对照品(板蓝根中的生物碱类型主要为吲哚类),经过溴甲酚绿酸性染料法处理,采用紫外分光光度法检测板蓝根总生物碱纯度为50.03%。板蓝根总木脂素部位同样采用大孔树脂分离,根据相同母核的紫外吸收具有相似性的原则,故采用紫外分光光度法,以代表性的木脂素类成分落叶松树脂醇为对照品,通过全波长扫描,逐一流份进行检查,分段分部收集与对照品紫外谱图一致的木脂素类成分,以保证收集的流份为与对照品结构类似的化学成分,富集得到的木脂素纯度为74.87%。板蓝根总有机酸部位采用乙酸乙酯萃取法,经过SA-2阳离子树脂,通过茚三酮反应检测去除样品中的氨基酸类成分,采用电位滴定法检测板蓝根总有机酸纯度为(以水杨酸计)74.81%。利用HPLC法,检测板蓝根三个部位的主要成分,与对照品比对,共鉴定出9个化合物,分别为水杨酸、表告依春、吲哚-2,3-二酮、2-吲哚酮、吲哚-3-甲醛、落叶松树脂醇-4,4·-二-O-β-D-葡萄糖苷、吲哚-3-乙腈、落叶松树脂醇和1-甲氧基-3-吲哚乙腈。上述所得三类总物质,作为后续研究受试样品。(2)板蓝根有效部位体内外抗病毒相关药效研究体外培养细胞制备病毒感染模型,然后给药干预,运用calcusyn软件分析评价联合用药的协同指数。当三个部位联合用药时,其抗病毒作用强于板蓝根各部位单独用药,稍弱于利巴韦林阳性药。当浓度小于100 μg/mL时,CI<1,表明在此浓度板蓝根三个有效部位在抗RSV病毒上具有协同作用。对于体内药效实验,采用小鼠灌胃给以板蓝根单部位及合用部位药物,滴鼻感染建立动物模型,观察小鼠肺损伤及肺泡灌洗液中干扰素β和炎性因子的变化。研究发现,三部位合用之后可以很好的保护小鼠肺损伤程度,并且可以抑制干扰素β和炎性因子的高表达,三部位高剂量组效果与利巴韦林阳性药无差异。(3)板蓝根不同有效部位协同抗病毒作用机制利用基因芯片技术,我们对药物作用前后的基因的进行差异性分析,筛选出可能作用的潜在靶点。通过经典通路中各分子在实验结果中的表达变化趋势及经典通路富集分析统计,我们找到并绘制了相关信号通路,经过分析发现排名前几位以感染免疫为主的通路,主要以T样、R样和N样受体家族为主的天然免疫信号通路,并且,前期研究中,我们已发现板蓝根可以调控TLR3通路,所以我们把关注点聚焦在含有MAVS交叉调控点的RIG-I/MDA5信号通路和JAK/STAT信号通路。分别用PCR和Western Blot检测信号通路中相关mRNA和蛋白的表达,结果显示,板蓝根总有机酸、木脂素、总生物碱三部位联合后对抗病毒免疫信号通路的调控作用强于各部位单独作用,且有机酸、木脂素和生物碱对通路中每个关键分子具有不同的调控作用。在RIG-I/MDA5信号通路中,木脂素对P-IRF3具有更强的下调作用,而生物碱对MDA5的下调作用更强,表明板蓝根的有效部位能够通过作用于不同通路的不同的靶分子来协同调控RIG-I和MDA5信号通路,从而发挥抗病毒协同作用;在JAK/STAT信号通路中,研究结果发现板蓝根各活性部位对JAK1/STAT1信号通路具有调控作用,且三部位成分存在着协同调控的作用,板蓝根三部位合用对STAT1和SOCS1分子无论是在mRNA水平上还是在蛋白的表达水平上均具有更强的下调作用。然而,研究结果发现板蓝根单一部位给药组对JAK1分子的调控作用强于板蓝根三部位合用组,这一结果提示我们,板蓝根中有机酸、木脂素和生物碱三个部位活性成分可能作用JAK1分子靶点的上下游,这也印证了中药的多成分多靶点的用药特点。