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第一部分:NO浓度对囊胚发育和孵化的影响目的:研究不同浓度的NO对囊胚发育和孵化率的影响。方法:(1)将获得的桑葚胚随机分为5组并在各组培养液中添加了不同浓度(0μM、125μM、250μM、500μM、5 m M)NOS的抑制剂(L-NAME),观察并统计各组囊胚发育及孵出率。(2)分别收集这5组的囊胚,用免疫荧光染色在蛋白水平上检测eNOS的表达及强度;并添加了不同浓度(0 n M、10 n M、100 n M、500 n M和2μM)SNP继续培养。收集囊胚并统计不同组囊胚的发育率和孵化率。(4)将获得的桑葚胚随机分为3组,在各组培养液中均添加5 m M L-NAME,另外在各组的培养液中添加不同浓度(10 n M、500 n M和2 u M)的SNP。结果:(1)125μM L-NAME对囊胚的发育和孵化率没有显著影响(P>0.05),但是随着L-NAME浓度的继续升高,囊胚的发育和孵化率显著减少(P<0.05),当L-NAME的浓度达到5 m M时则完全抑制了囊胚的孵化。(2)eNOS在囊胚细胞的细胞质中表达,随着L-NAME的浓度提高(0μM 125μM、250μM、500μM、5 m M),eNOS的表达逐渐降低,eNOS mRNA表达水平也随着L-NAME浓度的增加而呈现剂量依赖性降低。(3)10 n M SNP对囊胚的孵化率没有显著影响(P>0.05),100 n M、500 n M和2μM SNP显著降低了囊胚的孵化率,且随着培养液中SNP浓度的增加,囊胚的孵化率呈剂量依赖性地减少,SNP提升至2μM时则完全抑制了囊胚孵化。(4)适量NO底物SNP(10 n M)的添加可以逆转5 m M L-NAME对囊胚发育和孵化的抑制作用(P<0.05),但添加的SNP浓度过高则会降低囊胚的发育和孵化率(P<0.05)。结论:适量的NO浓度是保证囊胚孵出的必要条件,过低或者过高浓度的NO均会降低囊胚的孵化率。第二部分:NO/cGMP通路在囊胚孵化中的作用目的:研究NO是否通过cGMP信号转导途径调控囊胚孵化。方法:(1)对获得的桑葚胚随机分组,并在培养液中添加了不同浓度(0 n M、10 n M、100 n M、500 n M和2μM)的NO敏感的鸟苷酸环化酶的抑制剂(8-Br-cGMP),观察并统计各组囊胚发育及孵出率。(2)在囊胚的体外培养液中联合添加不同浓度(0 n M、10 n M、100 n M、500 n M和2μM)的8-Br-cGMP与5 m M L-NAME,观察并统计各组囊胚发育及孵出率。(3)收集各组的囊胚,用实时荧光定量PCR(SYBR Green法)在mRNA水平上检测各组组织蛋白酶cathepsin L和cathepsin P的表达情况。结果:(1)与对照组相比,10 n M、100 n M、500 n M和2μM 8-Br-cGMP显著降低囊胚孵化率(P<0.05),且随着8-Br-cGMP剂量浓度的增加,囊胚的孵化率显著减少,2μM 8-Br-cGMP完全抑制了囊胚的孵化。(2)10 n M和500 n M 8-Br-cGMP的添加显著促进了囊胚的孵化,部分逆转了5 m M L-NAME对囊胚孵化的抑制作用(P<0.05),但在2μM 8-Br-cGMP与5 m M L-NAME的联合添加组没有发现囊胚孵化现象。(3)L-NAME降低cathepsin L和cathepsin P mRNA的表达水平,最终导致囊胚孵化率的降低。结论:(1)NO是通过NO/cGMP信号转导途径来调控囊胚孵化的。(2)L-NAME降低cathepsin L和cathepsin P mRNA的表达水平,最终导致囊胚孵化率的降低。第三部分:NO对囊胚细胞凋亡的影响目的:研究NO对囊胚细胞凋亡的影响。方法:(1)本实验将5 m M L-NAME、2μM 8-Br-cGMP、10 nm SNP、500 nm SNP、2μM SNP单独添加并应用免疫荧光技术检测不同组囊胚细胞中活性caspase 3的表达水平,分析不同添加物对囊胚细胞凋亡的影响。(2)为进一步研究NO产生量对D5囊胚细胞凋亡的影响,本实验将5 m M L-NAME、2μM 8-Br-cGMP、10 nm SNP、500 nm SNP、2μM SNP单独添加并应用5μg/ml的碘化丙啶(PI)染坏死囊胚细胞,统计囊胚细胞活力并应用流式细胞术检测分析不同添加物对囊胚细胞凋亡的影响。结果:与对照组比较,5 m M L-NAME、2μM 8-Br-cGMP和10 nm SNP对囊胚细胞中caspase 3水平没有显著影响,而500 nm SNP和2μM SNP显著提高了囊胚细胞中caspase 3的水平(P<0.05),且呈剂量依赖性,随着SNP浓度的增加,caspase 3表达显著增强,促进了囊胚细胞的凋亡。(2)流式细胞仪结果显示,对照组细胞分布与5m M L-NAME,2u M cGMP,和10n M SNP组没有显著区别,但是500n M SNP和2u M SNP组,明显出现坏死细胞群。低浓度SNP的对囊胚孵化率的作用依赖于cGMP分子;(4)L-NAME,低浓度的SNP和8-Br-cGMP对囊胚细胞中活化型caspase 3的表达没有显著影响,而高浓度的SNP显著提高了囊胚细胞中活化型caspase 3的表达,促进了囊胚细胞凋亡。结论:过量NO引起的囊胚细胞凋亡不是通过cGMP途径实现,存在着其他NO参与调控Caspase 3的细胞凋亡途径。