基于色谱--质谱技术的花旗松素对急性肝损伤大鼠代谢网络的调控作用研究

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目的:  花旗松素是具有多种天然活性的二氢黄酮醇类化合物,是水红花子含量测定的指标成分。本实验进行花旗松素体外抗氧化活性实验,测定花旗松素对四种自由基的清除能力来评价花旗松素体外抗氧化活性。通过运用四氯化碳(CCl4)造成大鼠急性肝损伤模型,探究花旗松素对大鼠是否具有肝保护作用。从大鼠血清代谢组学分析、尿液代谢组学分析和脂肪酸含量种类变化三个方面探索花旗松素对大鼠急性肝损伤保护作用的可能机制。系统地、科学地评价药物的药效作用,为其应用于体内抗脂质过氧化以及保肝作用提供依据,拓展花旗松素在医疗领域的应用范围。  方法:  (1)以经典的水溶性抗氧化剂维生素C作为阳性对照药物,采用荧光分光光度法,进行羟自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验、2,2-联苯基-1-苦肼基(DPPH)自由基清除实验和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除实验对花旗松素体外清除自由基的能力进行验证,从而衡量其体外抗氧化活性。  (2)预防性给药花旗松素,用CCl4造成大鼠急性肝损伤模型,从整体和分子水平对肝脏毒性进行系统的研究。花旗松素给药剂量组分为高剂量组(150mg·kg-1)、中剂量组(100 mg·kg-1)、低剂量组(50 mg·kg-1)。花旗松素给予大鼠连续灌胃14天,腹腔注射CCl4造成大鼠急性肝损伤,造模后24 h取血及肝脏,计算肝指数,测定大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),运用试剂盒的方法测定肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活力和丙二醛(MDA)的含量,并进行病理组织学观察。  (3)从大鼠血清代谢组学、尿液代谢组学和脂肪酸含量种类变化这三方面对花旗松素肝保护作用机制进行研究。采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)分析其代谢谱变化,并鉴定差异性代谢物分析花旗松素可能影响的代谢通路;采用气相色谱(GC)技术分析各组大鼠肝脏和血清中脂肪酸含量和种类的差异。  结果:  (1)通过测算自由基抑制率以及寻找花旗松素与阳性对照抗氧化剂的量效浓度关系两种指标,评价花旗松素的体外抗氧化活性,结果表明花旗松素在一定浓度范围内对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基和ABTS自由基均具有良好的清除能力,并且对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力与阳性对照品维生素C相差无几。  (2)腹腔注射CCl4后,由于肝细胞损伤,大鼠ALT、AST均升高,但花旗松素高、中、低剂量组与模型组相比产生降低血清ALT、AST的作用;模型组大鼠SOD活性水平降低、MDA含量升高,给药花旗松素对SOD和MDA具有一定的回调作用;对肝组织进行组织形态学检查的结果表明,给药花旗松素组肝损伤程度较CCl4模型组小,并且高剂量组肝损伤程度最小,中剂量次之,低剂量程度较大,但仍比模型组损伤小。  (3)大鼠血清代谢组学方面,与正常组相比,模型组中共找出了30个差异性代谢物,正模式下鉴定出21个,负模式下共鉴定出9个,花旗松素给药组对其中24个代谢差异物的变化有回调趋势,并且这种回调趋势随着给药剂量的增加而增强。大鼠尿液代谢组学方面,共找出了44个差异性代谢物,正模式下鉴定出24个,负模式下共鉴定出20个,花旗松素给药后可以对其中的34个代谢差异物的变化有回调的趋势,并且这种回调转归的趋势随着给药剂量的增加而增强。CCl4造成急性化学性肝损伤模型大鼠肝组织和血清样本中几种主要脂肪酸的含量与正常组相比有差异,给药花旗松素对急性肝损伤大鼠肝组织样本中肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、二十碳一烯酸、二十碳二烯酸和二十二烷酸的含量具有向正常组调节的趋势,给药花旗松素对急性肝损伤大鼠血清样本中棕榈酸含量具有向正常组大鼠调节的趋势。  结论:  (1)初步证明花旗松素具有较好的体外抗氧化活性,为其在体内发挥肝保护作用的抗氧化活性提供依据。  (2)花旗松素对CCl4造成的化学性肝损伤具有很好的保护作用,且这种保护作用在一定剂量范围内随给药剂量的增高而增强。  (3)在血清代谢组学实验和尿液代谢组学中发现脂肪酸类、氨基酸类、甘油磷脂类、维生素类、胆汁酸类有显著性差异,为可能的代谢差异物。花旗松素的保肝作用机制可能和抗脂质过氧化以及调节胆汁酸代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和甘油磷脂代谢紊乱有关。
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