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瘤胃是反刍动物的重要消化器官,也是甲烷生成的重要场所,瘤胃内微生物的菌群结构变化会影响瘤胃内环境的稳定、饲料利用效率和甲烷排放,由于瘤胃纤毛原虫、细菌和甲烷菌间存在紧密的种间氢转移、共生和相互制约的关系,因此纤毛原虫的菌群结构变化可能进一步影响瘤胃细菌和甲烷菌的菌群结构变化。近年来发现茶皂素(TSS)因其特殊的生物学活性被作为一种瘤胃发酵调控剂,本研究以TSS为试验材料,利用qPCR和高通量测序技术,从微生物分类学上研究TSS对肉牛瘤胃纤毛原虫、细菌和甲烷菌的丰度和区系组成的影响,探明纤毛原虫、细菌和甲烷菌的菌群结构组成与肉牛瘤胃发酵和甲烷生成间的关系,以及TSS调控肉牛瘤胃发酵和甲烷生成的微生物学机制。试验一茶皂素对肉牛瘤胃纤毛原虫区系组成和甲烷生成的调控作用本试验选用6头安有瘤胃瘘管的贝尔蒙特红杂牛(体重为363±8.5 kg)作为研究对象,考察添加茶皂素前、添加期间和停止添加茶皂素后这三个阶段肉牛瘤胃中纤毛原虫区系组成和甲烷产量的变化。首先经过56d的驯饲期让肉牛从放牧饲喂到适应舍内饲喂高精料基础日粮(精粗比为77：23,DM基础)后进行正式试验,前2周继续饲喂基础日粮作为添加TSS前的对照阶段(BD),然后在晨饲基础日粮中添加TSS(30 g/d)饲喂20d(TSS添加阶段,TSS),最后2周饲喂不添加TSS的基础日粮(停止添加TSS后的对照,BDP)。分别在三个阶段的最后2d检测肉牛甲烷排放量并采集瘤胃液,利用qPCR和Illumina Miseq高通量测序技术分析纤毛原虫的丰度和区系组成变化。结果发现：1)内毛属、后毛属、真双毛属、多甲属和等毛虫属原虫是三个阶段肉牛瘤胃中的优势原虫属,添加TSS降低了利用淀粉的内毛属原虫的相对丰度(P<0.05),增加了利用纤维物质的多甲属和真双毛属原虫的相对丰度(P<0.05);2)在31个核心原虫OTUs中,添加TSS降低了内毛属和等毛虫属OTUs的比例,增加了多甲属和真双毛属OTUs的比例,但停止添加TSS后,内毛虫属OTUs的比例增加；3)添加TSS增加了纤毛原虫的总体丰度(P<0.05),但BDP阶段又降低恢复到BD阶段85%的水平；4)BDP阶段肉牛瘤胃中利用可溶性糖类的等毛虫属原虫的丰度低于BD和TSS阶段(P<0.05),而降解利用淀粉的后毛属原虫和降解纤维的多甲属原虫的丰度高于BD阶段(P<0.05)；5)添加TSS对肉牛的甲烷排放量无显著影响(P>0.05),但BDP阶段的甲烷排放量显著低于BD和TSS阶段(P<0.05)；6)等毛虫属原虫的丰度与肉牛甲烷排放量呈显著正相关(P<0.05),后毛属原虫的丰度与肉牛甲烷排放量呈显著负相关(P<0.05)。以上结果表明,在肉牛的高精料日粮中添加30 g/d TSS后,TSS通过抑制利用淀粉的内毛属原虫的增殖和促进利用纤维物质的多甲属和真双毛属原虫的增殖来改变瘤胃纤毛原虫的区系组成；另外,可通过降低与肉牛甲烷排放量呈显著负相关的等毛虫属的丰度或增加与肉牛甲烷排放量呈显著正相关的后毛属原虫的丰度来降低反刍动物瘤胃的甲烷排放量。试验二茶皂素对瘤胃细菌菌群组成和瘤胃发酵模式的调控作用瘤胃纤毛原虫与瘤胃细菌间存在捕食与被捕食、共生或寄生,以及竞争和协同关系,在了解茶皂素改变了瘤胃纤毛原虫区系组成的基础上,利用qPCR和Illumina Miseq高通量测序技术进一步探讨TSS对瘤胃细菌的丰度和菌群组成,以及瘤胃发酵的调控作用。结果发现：1)厚壁菌门(46.1%)和拟杆菌门(44.4%)是三个阶段肉牛瘤胃中的优势细菌菌门,普雷沃氏菌科(32.1%)、氨基酸球菌科(19.9%)和瘤胃菌科(11.3%)为优势菌科,普雷沃氏菌属(24.3%)和琥珀酸菌属(18.7%)为优势菌属；2)添加TSS降低了厚壁菌门的丰度,增加了变形菌门和纤维杆菌门的丰度(P<0.05),在属水平上,降低了丙酸生成菌(琥珀酸菌属)的丰度,增加了纤维降解菌(瘤胃球菌属和丁酸弧菌属)的丰度(P<0.05)；3)添加TSS降低厚壁菌门、氨基酸球菌科和琥珀酸菌属OTUs的比例,而增加了拟杆菌门、变形菌门和瘤胃球菌科OTUs的比例；4)添加TSS降低了黄色瘤胃球菌的丰度(P<0.05),增加了白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的丰度(P<0.05)；5)添加TSS降低了丙酸的摩尔浓度,增加了异丁酸的摩尔浓度(P<0.05),也提高了乙酸：丙酸的比例(P<0.05),使瘤胃发酵模式由丙酸型转为乙酸型。以上结果表明,TSS通过对瘤胃细菌在门、属和种水平上的差异性调控来改变其区系组成,即抑制丙酸生成菌(琥珀酸菌属)和黄色瘤胃球菌的增殖,促进了纤维降解菌中白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和丁酸弧菌属的增殖,使瘤胃发酵模式由丙酸型转为乙酸型。试验三茶皂素对肉牛瘤胃甲烷茵丰度和菌群组成的调控作用瘤胃纤毛原虫和细菌能够为甲烷菌生成甲烷提供所需的底物(代谢氢和一碳化合物),纤毛原虫还为一些甲烷菌提供生长繁殖生境。因此在了解TSS改变了瘤胃纤毛原虫和细菌区系组成的基础上,利用qPCR和Illumina Miseq高通量测序技术进一步探讨TSS对甲烷菌丰度和菌群组成的调控作用。结果发现：1)甲烷短杆菌属是肉牛瘤胃中的绝对优势甲烷菌属(>95%),另外系统进化树分析发现：在15个优势甲烷菌OTUs中,有86%以上(占13个OTUs)位于SGMT簇内,即SGMT簇甲烷菌是主要的优势甲烷菌簇；2)添加TSS增加了RCC甲烷菌的绝对丰度(P<0.05),但对总甲烷菌和甲烷短杆菌属甲烷菌的丰度无显著影响(P>0.05)。3)在种簇水平上,添加TSS降低了丰度高的SGMT簇甲烷菌的相对丰度,增加了丰度低的RO簇甲烷菌的相对丰度：4)系统进化树分析发现与等毛虫属原虫选择性共生的甲烷菌主要是SGMT簇甲烷菌,与多甲属原虫选择性共生的甲烷菌主要是RO簇甲烷菌。以上结果表明,TSS通过对瘤胃甲烷菌在种簇水平上的差异性调控改变了肉牛瘤胃甲烷菌的区系组成,即抑制与等毛虫属原虫选择性共生的丰度高的SGMT簇甲烷菌增殖和促进与多甲属原虫选择性共生的丰度低的RO簇甲烷菌的增殖。试验四不同甲烷菌产甲烷活性差异的比较研究本试验旨在比较优势甲烷短杆属甲烷菌中低丰度的RO簇的主要代表菌Mbr. ruminantium和高丰度的SGMT簇的主要代表菌Mbr. gottschalkii的生长指数和产甲烷活性差异。对2种甲烷菌进行时程(Time-course)培养试验,分别在13个时间点(0、8、12、16、20、24、30、36、48、60、72、84、96h)测定甲烷菌的生长指数和甲烷产量,并在DNA和RNA水平上研究甲烷菌的甲烷产量与甲烷菌丰度和产甲烷能力间的相关关系。结果发现：1)Mbr. ruminantium的对数增长期(40h)和稳定持续期(24h)均比Mbr. gottschalkii的对数增长期(36h)和稳定持续期(12h)长；2) Mbr. ruminantium的最大菌体量和最大比生长速率均显著高于Mbr. gottschalkii (P<0.05); 3)两种甲烷菌的累积甲烷产量与其丰度和mcrA基因表达水平均呈显著正相关(P<0.05),而且甲烷菌的丰度与其mcrA基因表达水平也呈显著正相关(P<0.05)；4)Mbr. ruminantium和Mbr. gottschalkii所消耗H2量差异不显著(P>0.05),但Mbr. ruminantium生成的CH4量显著高于Mbr. gottschalkii (P<0.05); 5) Mbr. ruminantium可在低氢浓度下继续生长产生少量甲烷,而Mbr. gottschalkii则不能利用低浓度的氢生成甲烷。以上结果表明,甲烷短杆菌属中低丰度的RO簇代表菌Mbr. ruminantium的产甲烷活性和对低浓度环境的适应能力要高于丰度高的SGMT簇代表菌Mbr. gottschalkii;另外甲烷菌的丰度和mcrA基因表达水平均可用于评定甲烷菌的产甲烷活性。综上所述,不同种属的纤毛原虫、细菌和甲烷菌对TSS的调控作用存在种属敏感差异性,在肉牛的高精料日粮中添加30 g/d TSS后,TSS改变了瘤胃微生物的菌群结构组成。对于瘤胃纤毛原虫,添加TSS选择性抑制了利用淀粉的原虫(内毛属)的增殖,促进了利用纤维物质的原虫(多甲属和真双毛属)的增殖；对于细菌,添加茶皂素选择性抑制了丙酸生成菌(琥珀酸菌属)和黄色瘤胃球菌的增殖,而促进了纤维降解菌中白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和丁酸弧菌属的增殖,使肉牛瘤胃发酵模式由丙酸型转为乙酸型；对于甲烷菌,添加茶皂素选择性抑制了甲烷短杆菌属中丰度高的SGMT簇甲烷菌的增殖,而促进了丰度低的RO簇甲烷菌的增殖。低丰度的RO簇甲烷菌代表菌Mbr. ruminantium产甲烷活性和对低浓度环境的适应能力均高于丰度高的SGMT簇甲烷菌代表菌Mbr. gottschalkii。茶皂素主要通过抑制与等毛虫属原虫选择性共生的丰度高产甲烷活性较低的SGMT簇甲烷菌的增殖和促进与多甲属原虫选择性共生的丰度低但产甲烷活性高的RO簇甲烷菌增殖来影响肉牛瘤胃的甲烷生成。