第一部分达格列净对血管紧张素Ⅱ刺激小鼠心脏成纤维细胞的蛋白质组及分泌组学研究【目的】运用蛋白质组定量技术,分析达格列净(Dapagliflozin,DAPA)干预对血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)刺激小鼠心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)蛋白以及分泌蛋白的直接影响,从而探讨差异表达蛋白和分泌蛋白与心室重构的关系,并预测其可能的作用机制。【方法】运用同位素标记的相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)技术并基于Proteome Discoverer 2.2搜索结果进行蛋白鉴定;采用GO分类工具对鉴定出的差异蛋白及分泌蛋白所参与的生物过程,细胞组成以及分子功能进行分类;应用Cluster Profiler对差异蛋白功能进行GO富集分析,通过显著性分析确定差异蛋白行使的主要生物学功能;应用String软件对蛋白-蛋白相互作用进行分析。【结果】1.CFs对照组与Ang Ⅱ刺激组的差异表达蛋白有210种,其中上调差异蛋白有62种,下调差异蛋白有148种;DAPA干预后,上调的差异蛋白中有12种发生回调,下调的差异蛋白中有31种回调。CFs对照组与Ang Ⅱ刺激组差异表达的分泌蛋白共有374种,其中上调的差异表达分泌蛋白有198种,下调的差异表达分泌蛋白有176种;DAPA干预后,上调的分泌蛋白中有57种发生回调,下调的分泌蛋白中有37种发生回调;提示DAPA对Ang Ⅱ刺激CFs的蛋白质组及分泌组干预广泛;2.DAPA干预后回调的差异蛋白以及分泌蛋白与纤维化、心肌细胞肥大以及凋亡密切相关,提示DAPA可能在Ang Ⅱ刺激下通过调节以上过程干预心室重构,为进一步研究提供了基础;3.回调的差异蛋白及分泌蛋白与心肌间质纤维化及心肌肥大相关通路MAPKs密切相关,提示DAPA可能通过上述信号通路对CFs和心肌细胞发挥作用。【结论】蛋白质组以及分泌组学分析为预测DAPA对CFs的直接作用及通过旁分泌对心肌细胞干预作用提供了整体而全面的认识。第二部分达格列净对压力后负荷诱导小鼠心室重构的保护作用及机制研究【目的】为了验证蛋白质组分析的结果,通过主动脉缩窄术(Transverse aortic constriction,TAC)构建压力后负荷诱导的小鼠心室重构模型,并早期给予DAPA干预,旨在探讨DAPA在非糖尿病性心室重构中的作用以及可能存在的信号转导机制。【方法】压力后负荷诱导的心室重构模型构建成功后,早期应用DAPA干预4周,通过小动物心脏超声对左心室收缩功能以及心室重构的相关指标进行检测;采用HE染色观察心肌结构的变化;应用Masson染色,天狼猩红染色以及免疫组织化学等技术检测心肌组织间质以及血管周围的胶原I和胶原ⅡI的分布情况;采用CCK8比色法及Ed U增殖实验评估DAPA干预对CFs增殖的影响;实时荧光定量PCR技术评估DAPA干预后小鼠CFs中I型胶原α1链以及ⅡI型胶原α1链的表达情况;通过划痕以及Transwell实验评估DAPA对CFs迁移能力的影响;采用Tunnel法检测心肌细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测MAPKs信号通路以及Fox O1的表达情况。【结果】1.压力后负荷诱导心室重构模型在构建成功后第4周已经开始出现左室心腔的扩大以及左室收缩功能下降,早期给予DAPA干预的TAC小鼠心室腔增大以及左室收缩功能下降的程度均得到改善;2.DAPA干预减轻了压力后负荷增加造成的心肌肥厚;3.给予DAPA干预治疗的小鼠心肌间质以及血管周围纤维化程度得到改善;另外DAPA可能是通过干预CFs细胞的增殖,胶原表达及迁移减轻纤维化;4.DAPA干预减轻了TAC组小鼠心肌细胞的凋亡情况;5.心肌间质纤维化以及心肌肥厚相关的P38 MAPKs及JNK信号通路可能参与了DAPA干预压力后负荷诱导心室重构的过程;另外DAPA可能通过抑制Fox O1的磷酸化减轻心肌细胞的凋亡。【结论】本部分结果证实了DAPA可以通过减轻心肌细胞肥大,心肌间质纤维化以及心肌细胞的凋亡从而改善压力后负荷诱导的心肌重构。因此DAPA有可能成为预防及改善非糖尿病性心肌重构的良好选择。