血管的生成是指从成熟血管生长出新的血管的过程,是炎症发生时的重要事件。多种生物因子可以激活血管内皮细胞中的信号分子,促进血管生成。研究发现,炎症时的血管生成与肿瘤性血管生成在细胞行为学上有很多相似之处。但是,有更多的证据显示参与炎症性血管生成时的信号分子、血管生成因子不同于参与其他类型的血管生成的信号分子。研究显示肿瘤坏死因子-α是影响血管内皮细胞迁移的重要炎症分子,参与调节血管生成。Pim家族是一类新发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包括Pim-1, Pim-2, Pim-3三种亚型,能影响生长因子依赖或非依赖性细胞凋亡过程。最近研究发现Pim激酶在心血管细胞的存活中发挥重要作用。Pim作为一种VEGF的反应基因,参与调节球囊损伤后的血管平滑肌细胞的增殖和心肌损伤后的细胞保护作用,还参与调节胚胎干细胞向内皮细胞的分化。Pim-3在血管内皮细胞上高表达,参与影响内皮细胞的迁移、增殖行为,在维持内皮细胞稳态中发挥重要生物学作用。本课题研究了Pim-3基因表达与肿瘤坏死因子-α的调节关系,并探讨了Pim-3基因在内皮细胞芽生中的生物学作用。第一部分：小鼠Pim-3基因RNA干扰慢病毒载体制备[目的]慢病毒(Lentivirus)载体以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础,是目前有发展前景的基因治疗载体。它在体内较长期的表达,可以感染分裂细胞和非分裂细胞。本研究拟构建针对小鼠Pim-3基因的RNA干扰慢病毒,感染小鼠源靶细胞,检测对内源性Pim-3基因表达的沉默效果,为随后开展的相关研究做基础。[方法]针对小鼠Pim-3基因序列,按照RNA干扰序列设计原则,设计多个潜在起干扰效应的RNA干扰靶点序列。合成含干扰序列的双链发夹DNA寡核苷酸片段。在DNA的末端加上粘性酶切位点,然后与酶切后的RNA干扰载体连接。将产物转化入感受态细菌中,并进行PCR鉴定。进一步扩增阳性克隆。随后用Lipofectamine2000将重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞。收集并浓缩含慢病毒颗粒的细胞上清。在293T细胞中测定病毒滴度。用慢病毒感染靶细胞,采用RT-PCR的方法及蛋白免疫印迹技术检测Pim-3基因的mRNA及蛋白表达情况。[结果]本研究运用双酶切法得到线性化慢病毒vshRNA载体,并将针对共四个靶点的DNA双链片段连接到线性化的pGCSIL-GFP载体。运用菌落PCR技术鉴定阳性克隆后分别得到4个针对第一靶点、5个针对第二靶点、4个针对第三靶点和第四靶点的阳性克隆。将重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞后得到病毒颗粒,滴度分别均为2E+9(TU/mL)。用慢病毒颗粒感染小鼠NIH3T3细胞,用Real-time PCR检测结果显示：NIH3T3细胞中,四个靶点中,KD1, KD4对NIH3T3目的基因的表达的敲减效率达到70%以上,为有效靶点。选择靶点一病毒,即Pim3-RNAi-LV-1进行随后实验。蛋白免疫印迹分析技术验证Pim3-RNAi-LV-1对内源性Pim-3基因蛋白水平沉默效率达到80%以上。[结论]本研究成功构建得到较高滴度慢病毒,并能有效沉默目的细胞中的Pim-3基因表达。第二部分：丝／苏氨酸蛋白激酶Pim-3被肿瘤坏死因子-α调节并促进血管内皮细胞芽生[目的]前期研究证实Pim-3在血管内皮细胞迁移与增殖中发挥重要作用,本研究则进一步探讨炎症分子肿瘤坏死因子-α对内皮细胞中Pim-3基因表达的影响,并证实Pim-3在血管内皮细胞芽生中的生物学作用。[方法]体外培养血管内皮细胞,用不同剂量TNF-α刺激内皮细胞不同时间,提取总RNA,运用RT-PCR技术检测Pim-3基因表达变化；合成针对TNF-α受体1和受体2特异的干扰片段,运用脂质体转染血管内皮细胞,敲低目的基因的表达水平,在此基础上观察TNF-a对Pim-3基因表达的影响；运用TNFR1中和抗体阻断TNF-α的受体1信号,并观察TNF-α对Pim-3基因表达的影响。运用放线菌素D阻断细胞mRNA合成,观察TNF-α处理后Pim-3基因mRNA稳定性的大小。运用细胞刮擦损伤实验观察内皮细胞丝状伪足形成能力；运用基质胶皮下植入实验研究在体条件下内皮细胞芽生能力。[结果](1)肿瘤坏死因子-α能够剂量依赖性促进血管内皮细胞中Pim-3mRNA表达,其对Pim-3mRNA表达的调节是瞬时性的,在1.5小时到2小时达到高峰。(2)TNF-α通过TNFR1促进血管内皮细胞中Pim-3mRNA表达,TNFR1中和抗体抑制TNF-a诱导的Pim-3mRNA表达。(3)PI3K、MAPK、ERK、NFκB、JNK信号通路阻断剂能不同程度增加内皮细胞Pim-3表达,而且都不能阻断TNF-a对Pim-3表达的调节作用。(4)TNF-a能够增加血管内皮细胞中Pim-3mRNA稳定性。(5)Pim-3基因沉默抑制]TNF-a诱导的培养内皮细胞丝状伪足的形成,Pim-3基因沉默抑制在体条件下得血管内皮细胞芽生。(6)Pim-3基因沉默降低内皮细胞中eNOS基因含量。[结论]血管内皮细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶Pim-3是TNF-α的靶基因,TNFR1介导了TNF-a对Pim-3的mRNA稳定性调节作用,Pim-3可能是炎症性血管生成过程中的重要信号分子。