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【目的】 1．建立黑色素瘤A375/威罗菲尼（vemurafenib）耐药细胞株A375-R0.5和A375-R2.0，并通过检测IC50及细胞增殖进行验证。 2．研究耐药黑色素瘤细胞A375-R0.5和A375-R2.0对vemurafenib的成瘾性。 【方法】 1. 构建 A375-R0.5/A375-R2.0 黑色素瘤耐药株：在常规培养的黑色素瘤A375细胞（A375-NC，敏感株）中，持续加入浓度为0.5 μmol/L或2.0 μmol/L的vemurafenib，连续培养约3个月，建成A375/vemurafenib耐药株A375-R0.5和A375-R2.0；然后用MTT法检测vemurafenib对耐药株与敏感株增殖的抑制率，并用GraphPad Prism 5软件进行分析，算出IC50值。在建立耐药株过程中，对细胞进行动态观察和衰老相关β-gal染色检测。 2. 黑色素瘤耐药株成瘾性检测：主要通过细胞克隆形成实验进行研究，将A375-NC/A375-R0.5/A375-R2.0三种细胞计数种于六孔板，根据情况加入或撤除vemurafenib，待克隆形成后进行结晶紫染色。 3. 通过 Western blot 检测蛋白表达水平，通过实时荧光定量 RT-PCR 检测mRNA表达水平。 【结果】 1．成功构建黑色素瘤A375/vemurafenib耐药株A375-R0.5和A375-R2.0。 在黑色素瘤A375细胞中连续加入0.5μmol/L或2.0μmol/L vemurafenib，处理后约3个月，细胞形态均一，增殖能力恢复，检测发现，A375-R0.5和A375-R2.0的IC50值明显大于A375-NC，说明产生了耐药性。 将A375-R0.5和A375-R2.0培养液中vemurafenib去除，培养4 d，再进行IC50检测，结果显示，A375-R0.5和A375-R2.0的IC50值仍明显大于A375-NC，说明耐药株构建成功。 2．A375/vemurafenib耐药株增殖能力检测 用alamarBlue? Assay检测细胞增殖，结果发现，在vemurafenib存在条件下，A375-R0.5和A375-R2.0的生长速率与A375-NC基本一致，而在A375-NC中加入vemurafenib后，细胞生长明显抑制。 3．A375/vemurafenib耐药株ERK蛋白活性检测 Western blot检测发现，敏感株和耐药株表达ERK1/2总蛋白无明显差异，而活化的磷酸化ERK蛋白在耐药株中表达低于敏感株，说明vemurafenib对耐药细胞的ERK蛋白仍有抑制作用。 4. A375/vemurafenib耐药株对vemurafenib有成瘾性 在常规培养的耐药株中（含vemurafenib），检测撤药对克隆形成能力的影响。结果显示，撤除vemurafenib后，耐药株A375-R0.5和A375-R2.0的克隆形成能力均下降，其中A375-R2.0下降更为显著。 如先将A375-R0.5和A375-R2.0中的vemurafenib撤除4 d，再进行克隆形成实验，结果发现，添加vemurafenib可以促进细胞的克隆形成，进一步证明耐药株具有药物成瘾性。 5. 撤除vemurafenib 对耐药株 BRAF-ERK-RSK1 通路及相关基因表达的影响 在耐药株撤药2 d或4 d，用Western blot检测BRAF-ERK-RSK1通路蛋白表达。结果发现，BRAF 和总 ERK 表达相对稳定，而 p-ERK 明显上调，ERK下游蛋白RSK1及p-RSK1均无显著变化，提示撤药后，ERK1/2活化，并通过RSK1以外的其他下游分子发挥作用。 结果还发现，耐药株撤药后，ERK 下游基因（IL-8、IL-1β 和 IL-1α）及细胞增殖等相关基因（P21、P16、FOSL1）在mRNA水平均呈上升趋势，而MITF mRNA变化不明显。进一步研究发现，在正常血清条件下，IL-8、IL-1α细胞因子或相应抗体对耐药或敏感细胞的克隆形成能力均无明显影响。这些结果提示，耐药株撤药后，可能通过上调P21、P16或FOSL1介导增殖抑制。 【结论】 1. 成功构建了黑色素瘤A375/vemurafenib耐药株A375-R0.5和A375-R2.0。 2. A375-R0.5和A375-R2.0细胞对vemurafenib产生了成瘾性，机制可能与撤药后ERK通路激活及P21, P16或FOSL1表达上调有关。