咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)是一种非细胞毒性抗肿瘤物质,对肿瘤细胞具有选择性的抑制作用,而对正常细胞几乎没有毒性作用。CAPE最早由蜂胶中提炼出来,是蜂胶抗肿瘤作用的主要活性成分,现在可以通过人工合成的方法获得。研究发现其抗肿瘤作用可能在于抑制异常的Wnt/β-catenin信号通路,调节细胞凋亡相关基因转录和表达,诱导细胞凋亡和抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)转录活性。Wnt/β-catenin信号传导通路是胚胎发育所必须的信号系统,过高或过低的表达都将改变细胞的生存状态。目前已经证实该系统的减低表达是引起阿尔茨海默病的重要原因,而过度激活则与多种人类肿瘤的发生有密切的联系。Wnt/β-catenin信号途径可概括为:Wnt→Frz→Dsh→β-catenin的降解复合体解散→β-catenin积累,进入细胞核→TCF/LEF→基因转录(如c-myc、cyclinD1、VEGF)。β-catenin与Tcf结合成复合物并发生核转位是此通路被过度激活的使动因素,下游癌基因的激活则是肿瘤发生发展的直接推动者。目前,在神经胶质瘤中已有关于干扰β-catenin表达的报道,但有关CAPE与神经胶质瘤中β-catenin表达的相关性目前还未见报道。我们考虑CAPE在神经胶质瘤中是作用于此信号通路的关键环节,也就是β-catenin的过表达与核转位。因为CAPE如果只是抑制了某个下游靶基因,则对上游基因影响很小。因此抑制上游关键基因,才会对抑制肿瘤起到明显的作用。本研究的主要目的是:①研究CAPE对神经胶质瘤的抑制作用②检测CAPE体内、外对神经胶质瘤异常Wnt/β-catenin通路β-catenin、Tcf-4及靶基因c-myc、VEGF的影响,探讨CAPE作用于该通路的靶点。我们以β-catenin为切入点,采用免疫荧光、实时荧光定量RT-PCR、流式细胞、Western blot等技术,观测CAPE在体内和体外对神经胶质瘤异常Wnt/β-catenin通路β-catenin、Tcf-4及靶基因c-myc、VEGF的影响,探讨CAPE作用于该通路的靶点,并构建重组腺病毒β-catenin及siRNA载体,探讨β-catenin在CAPE抑制肿瘤中的作用,从而研究CAPE对神经胶质瘤抑制作用的分子机制,以期为CAPE的研究提供理论基础。本实验的第一部分成功构建Ad-β-catenin与Ad-β-catenin siRNA腺病毒载体,使我们可以加强或抑制β-catenin在神经胶质瘤U251细胞株及裸鼠移植瘤的表达。通过后面实验对细胞株及移植瘤β-catenin mRNA和蛋白的检测,两种病毒转染率高,表达稳定,可以很好地用于胶质瘤异常Wnt/β-catenin通路的研究。本实验的第二部分通过流式细胞检测、激光共聚焦显微镜、实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)、Western blot等技术,我们观察到U251细胞株体外培养时给予CAPE干预后促进了细胞的凋亡,其基础表达、过表达、低表达的β-catenin均被进一步抑制,其下游的Tcf-4及靶基因c-myc、VEGF mRNA及蛋白均相应降低。实验结果提示:CAPE体外是通过抑制了U251细胞的β-catenin基因的表达与核转位,游靶基因的表达也相应下降,因此对神经胶质瘤起到一定的抑制作用。本实验的第三部分通过实时荧光定量PCR、Western blot等技术,我们观察到U251细胞荷瘤鼠在给予CAPE干预后,其基础表达、过表达、低表达的β-catenin均被进一步抑制,CAPE对移植瘤的抑瘤率达到48.39%(>40%为有效)。实验结果提示:CAPE体内同样是抑制了移植瘤的异常Wnt/β-catenin通路,对胶质瘤的抑制效果明显。综上所述,CAPE是通过抑制了神经胶质瘤U251细胞的异常Wnt/β-catenin通路中的β-catenin基因表达而对神经胶质瘤起到一定的抑制作用。