背景和目的：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)作为体内最常见的感染性病原体之一,现已公认是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤及胃癌等上消化道疾病重要的环境致病因素。随着研究的深入,Hp感染与胃肠外疾病的关系逐渐引起人们的关注,如特发性血小板减少性紫癜、特发性缺铁性贫血等已作为Hp根除适应症写入共识。既往研究认为Hp感染引起胃肠外疾病的相关机制包括诱导机体产生慢性低度炎症、通过分子模拟引发交叉免疫反应、阻碍营养物质或药物吸收等。近来不少流行病学调查资料提示Hp感染与代谢综合征(metabolic syndrome,MS)密切相关。MS是一组包括中心性肥胖、糖耐量异常、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱和高血压等多症状参与的代谢异常症候群,可明显增加糖尿病和心脑血管疾病的发生风险。随着人类饮食结构和生活方式的改变,如高脂高热量食物的摄入和静坐等生活方式的增多,MS在全球范围的患病率逐年上升,已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题之一。新近越来越多研究发现肠道菌群的失调参与肥胖、MS等代谢性疾病的发生和发展,Hp作为重要胃内致病菌其感染可引起胃肠道微生态改变,然而,到目前为止,还未见研究报道Hp感染、肠道菌群的变化和MS的发生这三者之间的关系。因此,本论文的研究目的是通过建立Hp感染联合高脂饮食动物模型,探讨在不同的饮食结构下Hp感染与MS的关系,并进一步观察肠道菌群的变化及其可能发挥的作用,为MS的预防提供新思路,同时也为确定MS是否作为Hp根除的适应症提供理论依据。材料和方法：1.建立两种Hp标准菌株(SS1、ATCC43504)感染C57BL/6小鼠的动物模型,同时以布氏肉汤灌胃的C57BL/6小鼠作为对照组,分别给予普通饮食和高脂饮食。2.监测动物的生长代谢情况,每隔2周测量体重和腹围,测定24h进食/进水量,计算能量摄入和能量利用率。3.检测不同饮食干预12周和24周后Hp感染组和对照组小鼠的葡萄糖耐量(IPGTT)和胰岛素耐量(IPITT),绘制相应曲线并计算曲线下面积(AUC)。4.检测不同饮食干预12周和24周后Hp感染组和对照组小鼠的各项血液生化指标。糖代谢指标包括应用血糖仪测定空腹血糖,ELISA法测定空腹血浆胰岛素,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);应用全自动生化分析仪检测血脂包括总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)；应用ELISA法检测代谢相关激素包括瘦素(Leptin)、抵抗素(Resistin)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(G1P)、胃饥饿素(Ghrelin)、胰高血糖素(Glucagon)的水平,及炎症细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF) -alpha、白介素(IL) -1β和IL-6。5.收集不同饮食干预12周和24周后Hp感染组和对照组小鼠的新鲜粪便样品,采用QIAamp DNA分离试剂盒提取细菌基因组DNA,扩增目标16S rRNA片段,混样、纯化、建库后完成上机准备。基于Illumina Miseq高通量测序平台对V4可变区进行双末端测序,应用生物信息学方法分析肠道菌群结构的变化。6.分别于不同饮食干预12周和24周后处死动物,分离肝脏及内脏脂肪组织,称重,计算重量指数,行Western blot检测肝脏组织胰岛素信号通路IRS1/PI3K/Akt相关蛋白的表达,以及冋肠黏膜组织紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的表达。结果：1.不同饮食干预12周和24周Hp感染对体重腹围的影响(1)高脂饮食组小鼠从第4周起体重即明显高于正常对照组(p<0.01),Hp感染组与未感染组之间体重无明显差异(p>0.05)。(2)不同饮食干预12周后高脂饮食组小鼠腹围较正常对照组明显增大(p<0.01),其中高脂饮食组中HpSS1感染亚组小鼠的腹围较对照亚组明显增大(p<0.05),而HpATCC43504感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组小鼠腹围无明显差异(p>0.05)。(3)不同饮食干预24周后高脂饮食组小鼠腹围明显大于正常对照组(p<0.01),其中高脂饮食组中HpSS1感染亚组小鼠的腹围明显大于对照亚组(p<0.05),而HpATCC43504感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05),普通饮食组中Hp感染亚组和对照亚组无明显差异(p>0.05)。2.不同饮食干预12周和24周Hp感染对脂肪含量和分布的影响(1)不同饮食干预12周后高脂饮食组小鼠内脏脂肪含量较正常对照组明显增高(p<0.01),其中高脂饮食组中HpSS1感染亚组较对照亚组明显增加(p<0.01),以附睾脂肪组织的变化最为明显,而HpATCC43504感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)；普通饮食组Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)。(2)不同饮食干预12周后高脂饮食组小鼠内脏脂肪指数明显高于正常对照组(p<0.01),其中高脂饮食组中Hp感染亚组的内脏脂肪指数明显高于对照亚组(p<0.01)；普通饮食组中Hp感染亚组较对照亚组无明显差异(p>0.05)。(3)不同饮食干预24周后高脂饮食组小鼠附睾脂肪含量较正常对照组明显增高(p<0.01),其中高脂饮食组中Hp感染亚组较对照亚组无明显差异(p>0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组附睾脂肪含量也无明显差异(p>0.05)。(4)不同饮食干预24周后高脂饮食组小鼠附睾脂肪指数较正常对照组明显增高(p<0.01),其中高脂饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组附睾脂肪指数也无明显差异(p>0.05)。3.不同饮食干预12周和24周Hp感染对能量代谢的影响(1)不同饮食干预12周后高脂对照组小鼠进食量低于正常对照组(p<0.05),高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组下降更明显(p<0.01)；普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组进食量无明显差异(p>0.05)。(2)不同饮食干预12周后高脂对照组小鼠饮水量较正常对照组无明显差异(p>0.05),而高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组明显下降(p<0.01)；普通饮食组中Hp感染亚组饮水量较对照亚组无明显差异。(3)不同饮食干预12周后高脂对照组小鼠能量摄入较正常对照组明显升高(p<0.05),而高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组无明显差异(p>0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组能量摄入无明显差异(p>0.05)；高脂对照组和高脂饮食合并Hp感染组能量利用率较正常对照组均明显升高(p<0.01),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组能量利用率无明显差异(p>0.05)。(4)不同饮食干预24周后高脂饮食组小鼠进食量较正常对照组无明显差异(p>0.05),而饮水量较正常对照组明显下降(p<0.05)；高脂对照组和高脂饮食合并HpSS1感染组小鼠能量摄入较正常对照组明显升高(p<0.05),而仅高脂对照组能量利用率高于正常对照组(p<0.01),高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组无明显差异(p>0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组均无明显差异(p>0.05)。4.不同饮食干预12周和24周Hp感染对糖脂代谢的影响(1)不同饮食干预12周后IPGTT结果显示高脂饮食组小鼠的AUC明显高于正常对照组(p<0.01),Hp感染组与未感染组无明显差异(p>0.05)；IPITT吉果显示高脂饮食组中Hp感染亚组的AUC明显高于对照亚组(p<0.01),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)。(2)不同饮食干预12周后高脂饮食组小鼠空腹血糖明显高于止常对照组(p<0.01),高脂饮食组中HpSS1感染亚组又明显高于对照亚组(p<0.01),HpATCC43504感染亚组与对照亚组比无明显差异(p>0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)；高脂饮食合并Hp感染组小鼠空腹血浆胰岛素明显高于正常对照组(p<0.05),而高脂对照组与正常对照组比无明显差异(p>0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异；高脂对照组小鼠HOMA-IR高于正常对照组(p<0.05),高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组更高(p<0.01),且高脂饮食合并HpATCC43504感染组HOMA-IR明显高于高脂对照组(p<0.01),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异。(3)不同饮食干预24周后IPGTT和IPITT结果均显示高脂饮食组小鼠的AUC明显高于正常对照组(p<0.01),Hp感染组与未感染组无明显差异(p>0.05)；高脂饮食组小鼠空腹血糖明显高于正常对照组(p<0.01),高脂饮食联合HpSS1感染组小鼠空腹血糖明显高于高脂对照组(p<0.01),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)；高脂饮食组小鼠空腹血浆胰岛素明显高于正常对照组(p<0.01),Hp感染组与未感染组无明显差异(p>0.05)；高脂饮食组小鼠HOMA-IR明显高于正常对照组(p<0.01),Hp感染组与未感染组无明显差异(p>0.05)。(4)不同饮食。干预12周后高脂饮食组小鼠血清TC明显高于正常对照组(p<0.05),Hp感染组与未感染组无显著差异(p>0.05)；高脂饮食合并HpSS1感染组小鼠血清TG明显高于正常对照组(p<0.01),高脂对照组与正常对照组无明显差异(p>0.05)；不同饮食干预24周高脂饮食组小鼠血清TC较正常对照组明显升高(p<0.01),各组之间的TG水平无明显差异(p>0.05)。5.不同饮食干预12周和24周Hp感染对炎症细胞因子和激素水平的影响(1)不同饮食干预12周后各组小鼠血清炎症因子TNF-α IL-1β 和 IL-6之间无明显差异(p>0.05)；24周结果显示,高脂饮食合并HpATCC43504感染组小鼠的血清IL-6明显高于正常对照组(p<0.05),而IL-1β和TNF-α无明显差异(p>0.05)，其余各组小鼠TNF-α IL-1β和IL-6之间均无明显差异(p>0.05)。(2)不同饮食干预12周高脂饮食组小鼠瘦素水平均明显高于正常对照组(p<0.01),普通饮食组中HpATCC43504感染亚组较对照亚组明显升高(p<0.05), HpSS1感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)；高脂对照组小鼠血清Resistin较正常对照组无明显差异(p>0.05),而高脂饮食联合Hp感染组显著升高(p<0.01),高脂饮食组中Hp感染亚组也明显高于对照亚组(p<0.01),而普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)；高脂对照组小鼠血清GIP较正常对照组无明显变化(p>0.05),而高脂饮食联合Hp感染组则显著升高(p<0.01),普通饮食组HpATCC43504感染亚组也明显高于正常对照组(p<0.01)；高脂对照组小鼠血清Ghrelin较正常对照组无明显差异(p>0.05),而高脂饮食联合HpATCC43504感染组则显著升高(p<0.05),且高脂饮食组中Hp感染亚组明显高于对照亚组(p<0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)；高脂对照组小鼠血清Glucagon较正常对照组无明显差异(p>0.05),而高脂饮食联合HpSSl感染组则显著降低(p<0.05),普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p>0.05)。(3)不同饮食干预24周后高脂对照组小鼠的血清Leptin较12周时显著升高(p<0.01),与高脂饮食联合Hp感染组之间无明显差异(p>0.05),均显著高于正常对照组(p<0.05)。同样,高脂对照组小鼠24周血清Resistin水平较12周时也显著升高(p<0.01),与高脂饮食联合Hp感染组无明显差异(p>0.05),均显著高于正常对照组(p<0.05)。6.不同饮食干预12周小鼠肝脏胰岛素信号通路IRS1/PI3K/Akt相关蛋白的表达(1)普通饮食合并Hp感染组和高脂对照组小鼠肝脏组织p-Akt (Ser473)的表达较正常对照组均无明显差异(p>0.05),而高脂饮食联合Hp感染组小鼠肝脏组织Akt蛋白Ser473位点磷酸化水平较高脂对照组和正常对照组均显著下降(p<0.01)。(2)普通饮食合并Hp感染组和高脂对照组小鼠肝脏组织p-IRS1 (Tyr896)的表达较正常对照组均无明显差异(p>0.05),而高脂饮食联合Hp感染组小鼠肝脏组织IRS1蛋白Tyr896位点磷酸化水平较正常对照组显著下降(p<0.01),高脂饮食合并HpSS1感染组更低于高脂对照组(p<0.01)。7.不同饮食干预12周和24周小鼠肠道菌群结构的变化及肠黏膜紧密连接蛋白表达(1)不同饮食干预12周Hp感染较饮食因素对肠道菌群的影响更大。PCoA分析和基于Unifra的UPGMA方法均显示高脂饮食组中Hp感染亚组小鼠与对照亚组肠道茵群结构存在显著差异(PC1贡献度为40.51%,PC3贡献度为9.33%)。与高脂对照组相比,高脂饮食合并Hp感染组小鼠肠道菌群α多样性指数中,chao指数和shannon指数显著增加而simpon指数下降。在门的水平上,高脂饮食合并Hp感染组较高脂对照组肠道菌群中厚壁菌门和变形菌门比例明显升高而拟杆菌门和疣微菌门比例显著降低。在科的水平上,与高脂对照组相比,高脂饮食合并Hp感染组小鼠肠道中Desulfovibrionaceae、Lachnospiraceae、 Helicobacteraceae、Ruminococcaceae 和 Deferribacteraceae细菌比例显著升高,而 Alcaligenaceae、Veillonellaceae、Paraprevotellaceae和S24-7细菌比例明显降低。在属的水平上,高脂饮食合并Hp感染组小鼠肠道内Akkermansia 和 Sutterella细菌比例明显减少,而Mucispirollum、Oscillospira 和 Helicobacter细菌比例明显增加。在Metastats分析的基础上,进一步应用LEfSe统计程序筛选发现高脂对照组和高脂饮食合并Hp感染组之间存在不同的Biomarker菌。而且,Desulfovibrionaceae菌和Akkermansia菌的丰度和胰岛素抵抗指数有显著的相关性,其中Desulfovibrionaceae呈正相关而Akkermansia呈负相关。(2)不同饮食干预12周普通饮食组中Hp感染亚组小鼠与对照亚组肠道菌群结构存在显著差异。普通饮食合并Hp感染组小鼠肠道菌群α多样性指数与正常对照组无明显差异。与正常对照组相比,普通饮食合并Hp感染组厚壁菌门明显增加而拟杆菌门明显下降,在科水平Deferribacteraceae、Helicobacteraceae和Spirochaetaceae细菌比例明显增加而Alcaligenaceae 和 Paraprevotellaceae细菌比例显著下降,在属水平Oscillospira、Mucispirillum 和 Treponema细菌比例增加而Sutterella 和 Parabacteroides细菌比例下降。(3)不同饮食干预24周饮食因素对肠道菌群结构的影响明显增强,占据主导地位而Hp感染因素的作用相对减弱。PCoA分析显示高脂饮食组小鼠肠道菌群结构与普通饮食组存在显著差异(PC1贡献度为43.4%,PC2贡献度为13.63%),通过样本的bray curtis聚类分析同样可以有效的将高脂饮食组和普通饮食组实现组间聚类。在门水平,与正常对照组相比,高脂对照组小鼠肠道菌群蓝藻细菌门和疣微菌门比例显著下降,在科水平Bifidobacteriaceae、 Erysipelotrichaceae、Lactobacillaceae 和 Verrucomicrobiaceae细菌比例明显下降,而Ruminococcaceae 和 Paraprevotellaceae细菌比例则明显增加,在属水平Akkermansia、Bifidobacterium、Lactobacillus 和 Allobaculum细菌比例显著降低而Oscillospira、Clostridium 和 AF12细茵比例明显升高。(4)不同饮食干预12周高脂饮食合并Hp感染组小鼠肠黏膜紧密连接蛋白ZO.1的表达显著低于其余各组,而高脂对照组和普通饮食合并Hp感染组与正常对照组相比无明显差异；高脂饮食合并HpSS1感染组小鼠肠黏膜紧密连接蛋白occludin的表达显著低于高脂对照组,高脂饮食合并HpATCC43504感染组与高脂对照组比无明显差异但显著低于正常对照组,高脂对照组occludin表达较正常对照组也明显下降,普通饮食Hp感染组与正常对照组比无明显差异；与高脂对照组比,高脂饮食合并Hp感染组小鼠肠黏膜紧密连接蛋白claudinl的表达水平显著降低,而高脂对照组和普通饮食合并Hp感染组与正常对照组比无明显差异。结论：1.Hp感染对MS的影响与饮食结构和作用时间密切相关,高脂饮食早期Hp感染可加重饮食诱导的胰岛素抵抗,促进脂肪重分布并加速腹型肥胖的发生,普通饮食下Hp感染对MS无明显影响。2.Hp感染对MS的影响可能与肠道茵群结构的变化有关,Hp感染和饮食对肠道茵群的调控可能影响宿主代谢平衡,进而引起MS的发生。