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研究背景和目的:宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤,发病率在我国妇科恶性肿瘤中居首位。宫颈癌的转移是影响患者预后的重要因素。肿瘤的恶性进展涉及到细胞的异常增殖与凋亡,对细胞外基质的粘附、侵袭以及迁移等过程。Rho GTP酶是一组鸟核苷酸调节蛋白,其介导的细胞运动可能在恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。近年来研究发现,RhoC与Rho家族其它成员相比,与其下游效应蛋白ROCK有更强的结合力,因而认为RhoC对细胞骨架介导的细胞运动具有更强的调节能力。RhoC的作用可能贯穿于肿瘤转移的全过程,是肿瘤转移过程中的一个重要“开关”基因,值得深入研究。此外,在肿瘤细胞的上皮间质转化过程中也发现有细胞骨架的改变,同时伴随着上皮细胞标记性蛋白E-cadherin的表达下降,而细胞内出现间质细胞标记性蛋白Vimentin,细胞具有更强的迁移和侵袭能力。宫颈癌来源于上皮组织,有研究证实E-cadherin表达减少与宫颈癌的转移密切相关。从而推测上皮间质转化在宫颈癌的转移中起一定作用。由于EMT的表现与RhoC效应的诸多相似性,这种相似性是因为两者之间具有一定的关联,还是彼此独立,值得进一步研究。因此本实验研究目的在于:1.在组织学水平探讨RhoGTP酶与宫颈癌恶性进展的关系。2.在细胞水平和分子水平,比较RhoC在不同宫颈癌细胞株中的表达,分析表达差异与粘附、侵袭和转移的关系。采用RNA干扰技术对RhoC进行沉默,研究RhoC对人宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡、粘附、侵袭等转移相关生物学行为的影响。体外模拟肿瘤恶性进展中,细胞表型转换过程,即上皮-间质转化过程,分析RhoC在此过程中的表达及活性的变化,并探讨沉默RhoC对该过程的影响。方法:1.研究RhoC在宫颈癌组织和细胞株中的表达。利用免疫组化方法和半定量RT-PCR方法检测正常宫颈组织、CIN组织和宫颈癌组织以及宫颈癌SiHa、HeLa和C33a细胞株RhoC蛋白和mRNA的表达,利用体外基质胶粘附实验、Transwell体外侵袭实验和迁移实验比较不同细胞之间粘附率、侵袭能力和迁移能力的差异,初步研究RhoC的表达水平与宫颈癌恶性进展以及与细胞体外粘附、侵袭和迁移能力的关系。2.研究RhoC对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。将RhoC siRNA转入SiHa细胞中,在RhoC基因沉默前后,分别用MTT细胞增殖实验检测细胞增殖活性,Annexin V-PI染色检测细胞凋亡率,体外基质胶粘附实验、Transwell体外侵袭实验和迁移实验比较细胞粘附率、侵袭能力和迁移能力的改变。3.分析上皮间质转化(EMT)对RhoC表达及活性的调控作用以及RhoC表达下调对上皮间质转化的影响。利用TGFβ1体外诱导宫颈癌细胞株SiHa发生上皮间质转化,以上皮表型的标志蛋白E-cadherin和间质表型的标志蛋白Vimentin免疫荧光染色和western blot方法检测的蛋白含量作为监测EMT的指标。western blot和Pull down实验检测EMT前后RhoC表达和活性的改变,同时利用体外侵袭实验比较SiHa细胞侵袭能力的变化。在TGFβ1刺激细胞前后,分别在细胞内转入RhoC siRNA,western blot检测E-cadherin和Vimentin的表达变化,观察EMT进程的变化。结果:1.RhoC在正常宫颈组织、CIN组织和宫颈癌组织中的表达逐渐增高,在有淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达明显高于无淋巴结转移组织。在SiHa细胞和HeLa细胞中的表达明显高于C33a细胞,前两者的粘附率、侵袭能力和迁移能力明显高于后者,而在SiHa细胞和HeLa细胞之间,以上指标均没有明显差异。2.RhoC的沉默可以明显降低SiHa细胞的体外粘附能力和侵袭、迁移能力,但对SiHa的增殖和凋亡没有明显影响。3.在TGFβ1诱导的EMT过程中,SiHa细胞的侵袭能力明显增强,同时,RhoC的蛋白表达及活性明显增强,沉默RhoC可明显降低SiHa细胞的侵袭力,EMT通过提高RhoC的表达及活性增强细胞侵袭能力。抑制RhoC的表达可以阻滞EMT过程,但不能逆转EMT过程。结论:1.宫颈癌中RhoC的表达与宫颈癌的进展和远处转移有关。RhoC主要参与调控宫颈癌细胞的粘附、侵袭和迁移等过程。2.RhoC能够介导TGFβ1诱导的EMT过程中的细胞侵袭能力增强。抑制RhoC的表达能够阻滞EMT的发生。