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在奶业生产中,人们期望借助性别控制技术获取更多的母牛。现有的性控技术远远不能满足奶业生产的需求,开发更为高效的性别控制技术具有重要的现实意义和广阔的应用前景。雄性特异性肌肉肥大转基因小鼠的成功制备实现了对小鼠Y染色体的基因打靶并特异性的提高了雄性转基因小鼠的生产性能。本研究的目的是期望通过基因打靶的方式将GFP基因定点整合到牛胎儿成纤维细胞的Y染色体上,并最终实现在牛的Y精子中或雄性胚胎中特异性表达绿色荧光蛋白,为大幅提高性别控制技术的效率提供可能。我们采集了两头发育40天的奶牛胎儿分别建立了胎儿成纤维细胞系。经PCR鉴定,两头胎儿中有一头是雄性胎儿,对应的细胞系命名为0195牛胎儿成纤维细胞。以载体p079 pPNT6为模板,利用PCR扩增出了长度为1952bp的片段,在扩增产物中靠近酶切位点KpnI的一端没有loxp位点。依据设计的酶切位点,用扩增产物替代载体p079 pPNT6上的相应片段,成功的将原载体中靠近酶切位点KpnI的loxp位点去除掉,构建了插入型打靶载体的骨架载体pPNT-loxp。以雄性胎儿的基因组DNA为模板,利用长片段PCR技术分别扩增出了3152bp和4147bp的USP9Y基因序列作为同源臂,在扩增长度为4147bp的片段时,将一个loxp位点引入到其5’端,在扩增长度为3152bp的片段时,将一个lox2272位点引入到其3’端。依据设计的酶切位点将两段同源臂先后插入到载体pPNT-loxp中,构建了牛Y染色体插入型打靶载体pPNTdloxp/USP9Y。利用类似的方法,我们分别将loxp位点和lox2272位点引入到pEGFP-N3载体中“CMV-EGFP”片段的两侧,构建了pEGFP-loxp-lox2272载体。利用pPNTdloxp/USP9Y打靶成功后,pEGFP-loxp-lox2272载体在Cre重组酶的介导下,能够将“CVM-EGFP”片段置换到Y染色体上。将pEGFP-loxp-lox2272载体用BamHI进行线性化,通过脂质体转染0195牛胎儿成纤维细胞。转染24小时后,消化细胞接种至96孔细胞培养板或48孔细胞培养板中,用G418浓度为600μg / mL的完全培养基筛选两周,然后用G418浓度为300μg / mL的完全培养基维持筛选两周,获得了82个扩大培养的细胞克隆。PCR鉴定结果显示在筛选到的细胞克隆中有一孔细胞中存在Y染色体打靶阳性的细胞。