【摘 要】
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岷江百合（Lilium regale Wilson）是我国特有野生种,对百合枯萎病致病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有较强抗性,是珍稀抗病野生百合种质资源。本研究基于前期岷江百合转录组测序数据筛选得到了一个响应尖孢镰刀菌诱导的defensin抗菌肽基因（LrDef1）,通过RT-PCR扩增获得LrDef1全长c DNA序列并对其进行了功能分析。利用q RT-PCR对LrDe
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岷江百合（Lilium regale Wilson）是我国特有野生种,对百合枯萎病致病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有较强抗性,是珍稀抗病野生百合种质资源。本研究基于前期岷江百合转录组测序数据筛选得到了一个响应尖孢镰刀菌诱导的defensin抗菌肽基因（LrDef1）,通过RT-PCR扩增获得LrDef1全长c DNA序列并对其进行了功能分析。利用q RT-PCR对LrDef1的表达谱进行分析;分析LrDef1的表达部位;诱导并纯化LrDef1重组蛋白,研究其体外抑菌活性;将LrDef1转入模式植物烟草（Nicotiana tabacum）中过量表达,以分析转基因烟草对尖孢镰刀菌的抗性。基于前期研究获得的岷江百合枯萎病正调控转录因子Lr WRKY3,研究Lr WRKY3对LrDef1的转录调控作用,为深入认识岷江百合抗病防卫反应的调控机理及揭示其响应尖孢镰刀菌入侵的分子机制提供依据。本论文的研究工作及取得的主要结果如下:1、通过RT-PCR克隆得到岷江百合defensin抗菌肽基因的c DNA序列,将其命名为LrDef1。LrDef1全长c DNA为501 bp,编码阅读框为225 bp,编码74个氨基酸残基组成的蛋白质。q RT-PCR结果表明,LrDef1在岷江百合的根、茎、叶、花和鳞片中差异表达,且其表达受尖孢镰刀菌侵染和四种逆境相关信号分子茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,Me JA）、水杨酸（salicylic acid,SA）、过氧化氢和乙烯利的诱导。2、构建p BIN m-gfp5-ER-LrDef1亚细胞定位载体转化洋葱（Allium cepa）表皮细胞进行瞬时表达,在共焦激光扫描显微镜下观察到LrDef1定位于植物细胞壁;构建p ET32a-LrDef1原核表达载体,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）进行异源表达获得LrDef1重组蛋白,平板抑菌实验表明LrDef1重组蛋白对交链格孢菌（Alternaria alternata）、茄腐镰刀菌（F.solani）和尖孢镰刀菌的生长具有抑制作用;构建过表达载体p CAMBIA2300s-LrDef1转入烟草中表达,获得T2代LrDef1转基因烟草;q RT-PCR分析显示,LrDef1在T2代转基因烟草中稳定表达,且LrDef1增强了烟草对尖孢镰刀菌的抗性。3、通过染色体步移技术扩增得到LrDef1的启动子片段（p LrDef1）,生物信息学分析表明p LrDef1含有能与WRKY转录因子专一性结合的W-box元件;凝胶阻滞实验结果显示Lr WRKY3-His重组蛋白能与含有W-box序列的p LrDef1片段特异性结合;构建诱饵载体p Ab Ai-p LrDef1和猎物载体p GADT7-Lr WRKY3进行酵母单杂交实验,结果表明Lr WRKY3在酵母中与p LrDef1结合并激活其转录;构建p LrDef1驱动β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）基因表达的植物载体p BI121-p LrDef1-GUS,分别转入Lr WRKY3转基因烟草和野生型烟草中;GUS活性分析表明,LrDef1启动子响应多种激素（脱落酸、SA和Me JA）处理和病原真菌（尖孢镰刀菌、草茎点霉Phoma tracheiphila和交链格孢菌）侵染;p LrDef1-GUS/Lr WRKY3共表达烟草的GUS活性显著高于p LrDef1-GUS转基因烟草,表明Lr WRKY3激活了LrDef1启动子下游报告基因的表达,从而增强了GUS活性。4、通过对Lr WRKY3转基因烟草进行转录组测序分析,差异表达基因KEGG通路富集结果显示Lr WRKY3转基因烟草中大量SA/JA信号通路、MAPK信号通路、类黄酮生物合成和植物-病原互作相关基因表达显著上调,其中包括两个烟草defensin抗菌肽基因;LC-MS检测结果显示Lr WRKY3在烟草中的表达提高了内源Me JA和Me SA含量,表明Lr WRKY3通过激活SA/JA信号转导途径、调控defensin等抗病基因的表达正调控岷江百合与尖孢镰刀菌的分子互作过程。综上所述,LrDef1是一个尖孢镰刀菌抗性基因,Lr WRKY3通过与LrDef1启动子中的W-box特异性结合并激活其转录,调控LrDef1的表达参与岷江百合与尖孢镰刀菌的分子互作。
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