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目的:微小RNA(mi RNA)与脑水肿的形成密切相关,但其机制尚不清楚。本研究旨在探讨脑出血后mi R-18a是否通过靶向结合RUNX1导致血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)紧密连接相关蛋白Occludin和ZO-1表达减少从而导致BBB通透性增高进而形成脑水肿的分子机制。方法:1.细胞实验:体外培养脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cell,BMVEC)与星形胶质细胞(Astrocyte,AC),采用VIII因子及神经胶质原纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)相关抗原免疫荧光分别鉴定BMVEC和AC表达,建立BMVEC与AC共培养的体外BBB细胞模型,分为八组:(1)模型组(model):BBB细胞模型建立好后加入20U/m L凝血酶培养24h构建体外脑出血BBB细胞模型;(2)过表达对照组:按照MOI=1:10(Multiplicity of Infection,MOI,即感染复数,指感染时病毒与细胞数量的比值)的比例加入mi R-18a过表达对照的腺病毒(空载体);(3)mi R-18a过表达组(mi R-18a):按照MOI=1:10的比例加入过表达mi R-18a的腺病毒(可以计算成细胞数量的10倍的病毒);(4)干扰对照组:按照MOI=1:10的比例加入mi R-18a干扰对照的腺病毒(空载体);(5)mi R-18a干扰组(sh-mi R-18a):按照MOI=1:10的比例加入干扰mi R-18a的腺病毒;(6)正常对照组:按照MOI=1:10的比例加入RUNX1过表达对照的腺病毒(空载体);(7)mi R-18a和RUNX1同时过表达组(mi R-18a+RUNX1):按照MOI=1:10的比例分别加入过表达mi R-18a及过表达RUNX1的腺病毒;(8)mi R-18a和RUNX1同时干扰组(sh-mi R-18a+sh-RUNX1):按照MOI=1:10的比例分别加入干扰mi R-18a及干扰RUNX1的腺病毒。通过腺病毒转染技术调控mi R-18a和RUNX1表达,应用跨内皮细胞电阻值(Transendothelial Electric Resistance,TEER)和荧光素钠(Fluorescein Sodium,Na-Flu)通透性实验评估体外脑出血BBB细胞模型的通透性,q RT-PCR及Western Blot检测mi R-18a、RUNX1、Occludin和ZO-1m RNA相对含量及蛋白水平的表达,采用双荧光素酶报告基因实验验证mi R-18a与RUNX1的靶向结合。2.动物实验:建立SD大鼠脑出血模型,分为六组:(1)假手术组(sham组,模拟大鼠脑出血的造模过程,不注血,作为对照组);(2)脑出血模型组(model组,大鼠基底节区注入自体非抗凝动脉血50μL制备脑出血模型);(3)mi R-18a过表达组(mi R-18a组,脑出血模型大鼠血肿周围4个点位置各注入过表达mi R-18a的腺病毒1μL);(4)mi R-18a干扰组(sh-mi R-18a组,脑出血模型大鼠血肿周围4个点位置各注入干扰mi R-18a的腺病毒1μL);(5)mi R-18a过表达+RUNX1过表达组(脑出血模型大鼠血肿周围4个点位置各注入过表达mi R-18a及过表达RUNX1的腺病毒2μL,注射前等体积混合病毒);(6)mi R-18a干扰+RUNX1干扰组(sh-mi R-18a+sh-RUNX1组,脑出血模型大鼠血肿周围4个点位置各注入干扰mi R-18a及干扰RUNX1的腺病毒2μL,注射前等体积混合病毒),以上六组大鼠每组又分为3d、5d、7 d三个亚组,每组10只大鼠,n=30。通过腺病毒转染技术调控mi R-18a和RUNX1表达,q RT-PCR及Western Blot检测血肿周围脑组织mi R-18a、RUNX1、Occludin和ZO-1m RNA相对含量及蛋白水平的表达,免疫荧光染色观察血肿周围脑组织RUNX1、Occludin和ZO-1蛋白的表达,同时观察大鼠神经功能评分、BBB通透性及脑组织水含量变化,应用染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术检测RUNX1与Occludin和ZO-1基因启动子区域的结合情况。结果:1.细胞实验:(1)通过VIII因子及GFAP相关抗原免疫荧光成功鉴定BMVEC与AC;(2)与模型组(model)比较,过表达mi R-18a导致体外脑出血BBB细胞模型TEER值降低、Na-Flu的比例增高,提示BBB通透性增高,组间差异有统计学意义(P<0.05),干扰mi R-18a则导致TEER值增高、Na-Flu的比例下降,表明BBB通透性降低,组间差异有统计学意义(P<0.05);(3)q RT-PCR及Western Blot均表明,与model组比较,过表达mi R-18a导致RUNX1、Occludin和ZO-1m RNA相对含量及蛋白水平下降,组间差异有统计学意义(P<0.05),干扰mi R-18a则导致上述三种蛋白表达增加,组间差异有统计学意义(P<0.05);(4)双荧光素酶报告基因实验表明,mi R-18a+RUNX1野生型质粒组相对荧光素酶活性较阴性对照+RUNX1野生型质粒组明显降低(P<0.05),表明mi R-18a能够与RUNX1m RNA 3′UTR结合,有效抑制野生型质粒荧光素酶活性,而mi R-18a+RUNX1突变型质粒组相对荧光素酶活性与阴性对照+RUNX1突变型质粒组比较无统计学意义(P>0.05),说明对RUNX1预测靶位点进行突变后,mi R-18a即无法与RUNX1突变型质粒结合,对荧光素酶活性无影响,表明mi R-18a同RUNX1具有靶向结合作用,RUNX1是mi R-18a的靶基因。2.动物实验:(1)成功建立SD大鼠脑出血模型;(2)q RT-PCR及Western Blot均表明,与模型组(model)比较,过表达mi R-18a导致RUNX1、Occludin和ZO-1m RNA相对含量及蛋白水平下降,干扰mi R-18a则导致上述三种蛋白表达增加,组间差异有统计学意义(P<0.05);(3)免疫荧光染色表明,与model组比较,过表达mi R-18a导致血肿周围脑组织RUNX1、Occludin和ZO-1蛋白表达减少,干扰mi R-18a则导致上述三种蛋白表达增加,组间差异有统计学意义(P<0.05);(4)大鼠神经功能评分在3d组达到峰值,5d组略有下降,7d组评分最低。与model组比较,过表达mi R-18a导致大鼠神经功能评分增加,干扰mi R-18a导致神经功能评分降低,表明干扰mi R-18a大鼠神经功能有改善,组间差异有统计学意义(P<0.05);(5)BBB通透性,与model组比较,过表达mi R-18a导致BBB通透性增高,干扰mi R-18a则导致BBB通透性降低,组间差异有统计学意义(P<0.05);(6)血肿周围脑组织含水量,与model组比较,过表达mi R-18a导致脑含水量增高,反之则减少,组间差异有统计学意义(P<0.05);(7)Ch IP-q PCR实验结果表明,与model组比较,过表达mi R-18a抑制了RUNX1与Occulin和ZO-1启动子的结合,干扰mi R-18a促进RUNX1与Occulin和ZO-1启动子的结合,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.在脑出血模型大鼠血肿周围脑组织中,mi R-18a与RUNX1的表达呈相反趋势,mi R-18a增高,RUNX1降低;2.mi R-18a能够与RUNX1m RNA的3′UTR结合,RUNX1是mi R-18a的靶基因,Occludin和ZO-1是RUNX1调控的目的蛋白,mi R-18a通过调控RUNX1表达从而抑制Occludin和ZO-1蛋白的表达,增加BBB的通透性,加重脑水肿;3.特异性阻断mi R-18a/RUNX1通路后,Occludin和ZO-1表达水平升高,BBB通透性降低,脑水肿程度降低,脑出血大鼠神经功能得到改善;4.在脑出血后第3d、5d、7d天不同时点,mi R-18a、RUNX1、Occludin以及ZO-1的表达不同,BBB的破坏以及脑水肿的严重程度不同,脑出血后3d组BBB通透性达到高峰。