周围神经缺损后的再生和功能恢复一直是神经外科领域的研究热点。近年来,组织工程技术的迅速发展为周围神经的修复带来了新的希望。组织工程化神经的关键是种子细胞、支架材料和神经营养因子。然而,如何选择合适的种子细胞、神经营养因子和支架材料仍然是目前急需解决的问题。脂肪源性干细胞(Adipose Tissue-Derived Stem Cells,ADSCs)和骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells ,BMSCs)具有多向分化潜能,都能分化为雪旺细胞,是两种最有应用前景的成体干细胞。一些研究已证实ADSCs和BMSCs作为种子细胞在短距离外周神经再生中发挥重要的作用。本课题分别使用ADSCs和BMSCs构建组织工程神经,比较了它们对犬5 cm长段外周神经缺损的修复效果,以期选择一种更理想的种子细胞。同时本研究还探索了ADSCs对犬9 cm超长段外周神经缺损的修复能力。实验分为以下四个部分:1.种子细胞的分离、培养及鉴定目的是建立一种体外分离和培养ADSCs、BMSCs的方法。无菌技术下切取实验动物双侧腹股沟脂肪垫,Ⅰ型胶原酶消化获取单细胞悬液,用含10 %胎牛血清的DMEM培养液培养,MTT比色法检测细胞增殖并绘制其生长曲线。采用Percoll分离液行密度梯度离心法分离BMSCs细胞,用含10 %胎牛血清的DMEM培养液体外扩增培养,同法检测细胞增殖。对分离的细胞分别采用多向诱导分化和流式细胞仪分析表面Marker的方法进行鉴定。结果显示:ADSCs和BMSCs成骨诱导后Von kossa染色都形成典型的黑色钙化结节,成脂诱导后油红染色阳性。ADSCs和BMSCs表面Marker检测结果均为:CD29和CD90阳性,CD45和CD80阴性。通过以上鉴定结果证实分离的两种细胞为所需的干细胞。2.体外定向诱导ADSCs和BMSCs向雪旺细胞分化的研究目的是观察ADSCs和BMSCs在体外向雪旺细胞诱导分化的能力。取同一动物第3代的ADSCs和BMSCs,分别采用化学诱导和共培养诱导两种方法进行诱导。通过体外动态观察细胞形态、免疫细胞化学、western blot及RT-PCR等手段对各组诱导后的细胞进行鉴定。结果显示两种干细胞诱导后都出现明显的雪旺细胞的形态,对照组细胞形态无变化。免疫细胞化学染色、western blot和RT-PCR结果显示两种干细胞诱导后都能够表达神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白。3.去细胞神经支架的制备目的制备去细胞神经支架并评测其生物相容性。方法:犬坐骨神经使用低渗、-80℃反复冻融和NaOH裂解等方法制备去细胞神经异体移植物,光镜、电镜观察其结构特征。使用细胞毒性试验、皮下植入试验来评价去细胞神经同种异体移植物的生物相容性。结果显示正常犬的坐骨神经经过脱细胞方法处理后,清除了雪旺细胞、神经外膜和束膜的细胞,以及神经纤维的髓鞘和轴突,保存了由雪旺细胞基底膜管以及神经外膜和束膜的细胞外基质构成的三维支架结构。生物相容性测试结果显示去细胞神经同种异体移植物细胞毒性试验为1级,SD大鼠皮下植入试验无明显的免疫排斥反应。4.组织工程周围神经的体外构建及修复犬坐骨神经缺损的实验研究把TGFβ1+ADSCs和TGFβ1+BMSCs分别复合于胶原凝胶中,然后注入去细胞神经支架中制备成组织工程神经移植物。实验分为两组,5cm实验组,A组:ADSCs+去细胞神经支架+TGFβ1;B组:BMSCs+去细胞神经支架+ TGFβ1;C组:胶原+去细胞神经支架+TGFβ1;D组5cm自体神经移植组。9cm实验组,A组:ADSCs+去细胞神经支架+ TGFβ1;B组:胶原+去细胞神经支架+TGFβ1;C组:9cm自体神经移植组。修复犬坐骨神经缺损后6个月,通过电镜、免疫组化、图像分析、电生理、逆行示踪等方法进行神经再生评价。结果显示5cm组中,A组和B组修复效果与自体神经移植组D接近,而A组和B组修复效果无显著差异,C组修复效果较差。9cm组中,A组和C组相似,B组修复效果最差。结论:使用ADSCs和BMSCs构建的组织工程神经都能成功修复5cm外周神经缺损,修复效果无显著差异,同时ADSCs构建的组织工程神经也能修复9cm超长段外周神经缺损。考虑到ADSCs来源广泛、取材方便、自体取材创伤小等优势,ADSCs或许是一种更理想的种子细胞。