背景及目的大肠癌是世界重大公共健康问题,发病率居高不下。虽然目前已有手术、化疗、靶向治疗等方法,但治疗效果有限,大肠癌的死亡率仍然排名靠前,因此寻求新的治疗靶点迫在眉睫。随着研究进展,大肠癌表观遗传学改变受到关注。单ADP核糖基化是表观遗传的一种,但在大肠癌中的修饰水平及修饰靶蛋白尚不明确。本研究小组前期研究表明,催化单ADP核糖基化修饰催化酶ARTD8和ARTD14在大肠癌中表达较对照大肠组织显著增加,并且两者在大肠癌细胞胞核中都有表达,提示大肠癌细胞核内存在异常的单ADP核糖基化修饰;对大肠癌细胞系组蛋白单ADP核糖基化修饰进行高效液相串联质谱分析,发现LoVo细胞组蛋白H3第117位精氨酸（H3R117）存在单ADP核糖基化修饰;该位点修饰能抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等;在改变了H3第117位精氨酸单ADP核糖基化状态的LoVo细胞转录组分析中,发现其固醇调节元件结合转录因子1（SREBP1）和脂肪酸合成酶（FASN）基因表达降低,与脂代谢密切相关。越来越多的证据表明脂代谢紊乱与大肠癌有一定关系,可能在早期就参与大肠癌的发展,但具体机制还不明确。IGFBP1是调控IGF-1发挥作用的分子开关,且IGFBP1在大肠癌中水平较低。课题组前期研究结果亦显示,H3R117单ADP核糖基化修饰可调节DNA甲基化和组蛋白修饰,抑制抑癌基因表达,但是否影响IGFBP1甲基化还不清楚。本研究将在前期研究基础上,分析大肠癌细胞核单ADP核糖基化修饰水平,探索LoVo细胞H3R117单ADP核糖基化修饰是否调节IGFBP1启动子甲基化并影响细胞脂代谢,在大肠癌凋亡中发挥作用,为寻找大肠癌治疗潜在靶点提供新的思路及实验依据。方法本研究分为三部分:1、结直肠癌细胞核单ADP核糖基化水平的分析采用免疫组化方法检测64例大肠癌和对照大肠组织细胞核单ADP核糖基化修饰水平,并分析其与临床病理特征的关系。2、H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞脂代谢及凋亡的影响（1）H3 R117单ADP核糖基化对LoVo细胞脂代谢影响实验分为四组:选用课题组前期已成功构建的H3R117单ADP核糖基化修饰位点突变的大肠癌LoVo细胞（将组蛋白H3第117位精氨酸突变为丙氨酸和赖氨酸）为实验对象:突变组1（Mut-1）,即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞,突变组2（Mut-2）,即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞,观察H3R117单ADP核糖基化修饰的作用。空载组（empty vector）即转染空载体LoVo细胞和未经处理LoVo细胞（control）作为对照。1)ELISA检测细胞胆固醇和脂肪酸含量。2)ELISA检测细胞培养上清液IGF-1水平。3)Western Blot检测细胞IGFBP1、IGF-1R和SREBP1的表达水平。4)q RT-PCR检测细胞ACC、ACLY、FASN和HMGCR mRNA表达水平。（2）H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞凋亡影响采用小干扰RNA敲低IGFBP1基因。实验分为六组:未经处理LoVo细胞（control）;空载组（empty vector）;突变组1（Mut-1）,即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞;突变组2（Mut-2）即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞;突变组1+si-IGFBP1（Mut-1+si-IGFBP1）,即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸同时敲低IGFBP1基因LoVo细胞;突变组2+si-IGFBP1（Mut-2+si-IGFBP1）,即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸同时敲低IGFBP1基因LoVo细胞。1)在敲低IGFBP1后,采用ELISA检测LoVo细胞培养上清液IGF-1总体水平,采用Western Blot检测LoVo细胞IGFBP1的蛋白表达水平,采用q RT-PCR检测LoVo细胞IGF-1R、SREBP1、ACC、FASN和HMGCR mRNA表达水平。2)拉曼共聚焦显微镜检测敲低IGFBP1对细胞胆固醇的影响。3)Western Blot检测敲低IGFBP1对细胞膜脂筏、胞核和胞质IGF-1R表达的影响。4)Western Blot检测敲低IGFBP1对细胞Caspase3表达的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率。5)H3 R117单ADP核糖基化对移植瘤IGFBP1、IGF-1R、SREBP1和Caspase3表达的影响A.建立裸鼠皮下移植瘤模型,实验分为四组:未经处理LoVo细胞（control）,空载组（empty vector）,突变组1（Mut-1）即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞,突变组2（Mut-2）即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞。B.测量移植瘤瘤体最大径a和最小径b,按照V=ab2/2（cm3）计算皮下移植瘤体积。C.提取移植瘤组织蛋白,采用Western Bolt检测移植瘤组织IGFBP1、IGF-1R、SREBP1和Caspase3的表达。3、H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1影响LoVo细胞脂代谢及凋亡的机制研究（1）H3 R117单ADP核糖基化对IGFBP1启动子甲基化的影响实验分为四组:未经处理LoVo细胞（control）,空载组（empty vector）,突变组1（Mut-1）即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞,突变组2（Mut-2）即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞。1)采用Disease Meth version 2.0数据库分析大肠癌和对照大肠组织IGFBP1启动子甲基化水平。2)重亚硫酸盐测序法检测四组细胞IGFBP1启动子甲基化水平。3)ChIP检测H3R117单ADP核糖基化对IGFBP1基因启动子H3K9me2/3水平以及HP1α和DNMT1富集的影响。4)Western Bolt检测H3R117单ADP核糖基化对组蛋白瓜氨酸化H3cit表达的影响。5)Ch IP检测H3R117单ADP核糖基化对IGFBP1基因启动子H3cit水平的影响。（2）H3 R117单ADP核糖基化经H3cit对IGFBP1启动子甲基化的影响采用抑制剂Cl-amidine抑制组蛋白瓜氨酸化。实验分为六组:未经处理LoVo细胞（control）;空载组（empty vector）;突变组1（Mut-1）即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞;突变组2（Mut-2）即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞;突变组1+Cl-amidine（Mut-1+Cl-amidine）,即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞同时加入抑制剂Cl-amidine;突变组2+Cl-amidine（Mut-2+Cl-amidine）,即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞同时加入抑制剂Cl-amidine。1)CCK-8方法选取抑制剂Cl-amidine作用细胞的时间和浓度;Western Blot检测抑制剂Cl-amidine对H3cit和IGFBP1蛋白表达的影响。2)激光共聚焦显微镜观察加入抑制剂Cl-amidine后HP1α和DNMT1的共定位。3)甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR法检测加入抑制剂Cl-amidine对IGFBP1启动子甲基化水平的影响。结果1.结直肠癌细胞核单ADP核糖基化水平的分析（1）免疫组化结果显示,单ADP核糖基化在大肠癌和对照大肠组织中均有阳性染色,在大肠癌中的水平较对照大肠组织显著增加（p<0.05）,在细胞核中表达亦较对照大肠组织增加（p<0.05）。（2）对大肠癌的临床病理特征进行分析,结果显示,随着肿瘤浸润深度和肿瘤分级的增加,大肠癌细胞核中单ADP核糖基化水平逐渐增加,细胞核中单ADP核糖基化水平与浸润深度成正相关（p<0.05）,与肿瘤分级成正相关（p<0.05）,与性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结转移和TNM分期无关（p>0.05）。2.H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞脂代谢及凋亡的影响（1）H3 R117单ADP核糖基化对LoVo细胞脂代谢影响1)ELISA检测细胞胆固醇和脂肪酸含量,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组细胞的脂肪酸和胆固醇含量显著减少（p<0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组比较均无统计学差异（p>0.05）。2)ELISA检测细胞培养上清液IGF-1水平,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组细胞培养上清液IGF-1水平显著减少（p<0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组比较均无统计学差异（p>0.05）。3)Western Blot检测细胞IGFBP1、IGF-1R和SREBP1的表达水平,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组IGFBP1蛋白表达增加,IGF-1R、SREBP1蛋白表达降低（p<0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组比较均无统计学差异（p>0.05）。4)qRT-PCR检测LoVo细胞脂肪酸和胆固醇合成限速酶ACLY、FASN、ACC和HMGCR的表达,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组ACC、FASN和HMGCR mRNA表达降低（p<0.05）,ACLY无差异（p>0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组比较均无统计学差异（p>0.05）。（2）H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞凋亡影响1)采用小干扰RNA敲低IGFBP1基因,选取si-IGFBP1-2为最优序列。ELISA检测敲低IGFBP1后细胞培养上清液IGF-1水平,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的细胞培养上清液IGF-1水平显著增加（p<0.05）。对照组和空载组间、突变1组和突变2组、突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1比较均无统计学差异（p>0.05）。2)Western Blot检测敲低IGFBP1后LoVo细胞IGFBP1的蛋白表达水平,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1 IGFBP1蛋白表达降低（p<0.05）。对照组和空载组间、突变1组和突变2组、突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1比较均无统计学差异（p>0.05）。3)qRT-PCR检测敲低IGFBP1后细胞IGF-1R、SREBP1、ACC、FASN和HMGCR mRNA表达水平,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的IGF-1R、SREBP1、ACC、FASN和HMGCR的mRNA表达显著增加（p<0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组、突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1比较均无统计学差异（p>0.05）。4)拉曼共聚焦显微镜检测敲低IGFBP1对细胞胆固醇的影响,结果显示,胆固醇标准品特征峰在1439cm-1处;与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的拉曼强度均显著增加（p<0.05）,细胞胆固醇含量增加。对照组和空载组间、突变1组和突变2组间、突变1+si-IGFBP1组和突变2+si-IGFBP1组间的拉曼强度没有统计学差异（p>0.05）。5)Western Blot检测敲低IGFBP1对细胞膜脂筏、胞核和胞质IGF-1R表达的影响,结果显示,与突变1组和突变2组相比,敲低IGFBP1后突变的两组细胞脂筏、细胞核和细胞质的IGF-1R均显著增加（p<0.05）。6)Western Blot检测敲低IGFBP1对细胞Caspase3表达的影响,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的Caspase3裂解减少（p<0.05）;敲低IGFBP1后,流式细胞术检测LoVo细胞的凋亡率,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的细胞凋亡率下降（p<0.05）。对照组和空载组间、突变1组和突变2组间、突变1+si-IGFBP1组和突变2+si-IGFBP1组间比较无统计学差异（p>0.05）。7)裸鼠皮下移植瘤构建成功,计算皮下移植瘤体积,结果显示,与对照组和空载组相比,突变1组和突变2组的皮下移植瘤体积显著减小（p<0.05）。Western Blot检测结果显示,与对照组和空载组相比,突变1组和突变2组的IGFBP1表达增加,IGF-1R和SREBP1蛋白表达降低,Caspase3裂解增加（p<0.05）。对照组和空载组间、突变1组和突变2组间比较无统计学差异（p>0.05）。3.H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1影响LoVo细胞脂代谢及凋亡的机制研究（1）H3 R117单ADP核糖基化对IGFBP1启动子甲基化的影响1)生物信息学分析大肠癌和对照大肠组织IGFBP1启动子甲基化水平,结果显示,大肠癌组织IGFBP1启动子甲基化水平较对照大肠组织显著增加（p<0.05）。2)重亚硫酸盐测序法检测IGFBP1启动子甲基化水平,结果显示,突变1组和突变2组细胞IGFBP1启动子甲基化水平较对照组和空载组显著降低（p<0.05）。对照和空载组、突变1组和突变2组之间无统计学意义（p>0.05）。3)Ch IP检测H3R117单ADP核糖基化对IGFBP1基因启动子H3K9me2/3水平以及HP1α和DNMT1富集的影响,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组细胞IGFBP1启动子片断上H3K9me2修饰水平、HP1α和DNMT1的富集显著降低（p<0.05）,H3K9me3修饰水平无统计学差异（p>0.05）。对照和空载比较、突变1组和突变2组比较均无统计学意义（p>0.05）。4)Western Bolt检测H3R117单ADP核糖基化对组蛋白H3cit表达的影响,结果显示,与对照和空载组比较,突变1组和突变2组的H3cit表达显著增加（p<0.05）。对照和空载比较、突变1组和突变2组比较均无统计学意义（p>0.05）。5)ChIP检测H3R117单ADP核糖基化对IGFBP1基因启动子H3cit水平的影响,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组细胞IGFBP1启动子片断上有更多的H3cit修饰（p<0.05）。对照和空载比较、突变1组和突变2组比较均无统计学意义（p>0.05）。（2）H3 R117单ADP核糖基化经H3cit对IGFBP1启动子甲基化的影响1)选取瓜氨酸化抑制剂Cl-amidine作用浓度200μM,作用时间48 h。Western Blot检测抑制剂Cl-amidine对H3cit和IGFBP1蛋白表达的影响,结果显示,与突变1组和突变2组相比,加入Cl-amidine后两组的H3cit和IGFBP1蛋白表达显著降低（p<0.05）。对照和空载组间、突变1组和突变2组间、突变1+Cl-amidine组和突变2+Cl-amidine组间均无统计学差异（p>0.05）。2)激光共聚焦显微镜观察加入抑制剂Cl-amidine后HP1α和DNMT1的共定位,结果显示,绿色荧光HP1α和红色荧光DNMT1共定位显示为橘黄色荧光,与未加Cl-amidine时相比,突变的两组细胞加入Cl-amidine后与HP1α共定位的DNMT1均增加。3)甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR法检测加入抑制剂Cl-amidine对IGFBP1启动子甲基化水平的影响,结果显示,与未加Cl-amidine时相比,突变的两组细胞加入Cl-amidine后IGFBP1启动子5m C的富集显著增加（p<0.05）,IGFBP1启动子甲基化水平增加。对照和空载组之间、突变1组和突变2组之间、突变1+Cl-amidine组和突变2+Cl-amidine组之间没有差别（p>0.05）。结论1.大肠癌细胞核内存在的单ADP核糖基化修饰与肿瘤侵袭深度和分级呈正相关,随着肿瘤细胞核内单ADP核糖基化修饰水平的增加,肿瘤浸润深度越深,分级越高。提示单ADP核糖基化修饰参与大肠癌的进展。2.大肠癌细胞组蛋白H3R117单ADP核糖基化修饰可上调IGFBP1启动子甲基化水平,并与启动子片段上H3cit修饰水平降低、H3K9me2修饰水平增加、以及HP1α和DNMT1的富集增加有关。大肠癌IGFBP1基因启动子的甲基化水平增加,可增加大肠癌胆固醇合成,抑制细胞凋亡,从而在大肠癌发展过程中发挥促进作用。本研究丰富了大肠癌表观遗传学的内容,为H3R117单ADP核糖基化修饰成为大肠癌的靶点提供了新的思路及一定的实验依据。