蛋白酶和蛋白激酶普遍存在于生物体内并参与各项生命活动，对蛋白酶和蛋白激酶的检测不仅能使我们更好的理解生命过程，对于人们的生产生活、疾病的诊断治疗方面都有着极大的意义。绿色荧光蛋白（GFP）是一种由238个氨基酸构成的，在紫外光激发下能发射出强烈绿色荧光的蛋白。在细胞和分子生物学中，绿色荧光蛋白通常可以通过分子克隆手段与其它分子在体内体外融合构建生物传感器。与一般在体内具有毒性的荧光小分子不同（如FITC），荧光蛋白对细胞的毒性较小，有很好的生物相容性。这个优势促使了绿色荧光蛋白在生物检测方面的应用发展，如活体内荧光成像，DNA/RNA标记，或研究体内外蛋白间的相互作用等。但目前荧光蛋白在蛋白酶和蛋白激酶活性检测方面的应用较少，所以急需开发荧光蛋白在该方面的检测方法。本论文利用重组加强型绿色荧光蛋白（enhanced fluorescence protein, EGFP）和基于荧光蛋白的自组装双分子荧光互补对（self-assembling BimolecularFluorescence Complementation, self-assembling BiFC），开发了两种无标记蛋白酶和蛋白激酶的荧光检测方法。1、结合EGFP的自发荧光特性和镍离子-氮三乙酸修饰的磁纳米颗粒（Ni2+-NTAMNPs）的磁富集特性，开发了一种无标记、简单的凝血酶荧光检测方法。N端带有组氨酸标签（His-tag）和凝血酶识别位点的绿色荧光蛋白通过His tag-Ni2+-NTA之间的螯合作用结合在Ni2+-NTA MNPs的表面，并在外界磁场存在下被Ni2+-NTAMNPs分离出上清液。当凝血酶存在时，位于N端His-tag和EGFP序列间的凝血酶识别多肽被特异性切割，使EGFP与His-tag分离，不会被吸附到Ni2+-NTA MNPs表面，从而EGFP在外界磁场存在下仍然留在上清液中，使上清液荧光强度保持在较高水平。因此，该体系中上清液荧光的改变可以反应体系中凝血酶的含量。在优化后的实验条件下，该方法对凝血酶有较低的检测限（3.0×10-4U mL-1），并用此方法检测了凝血酶的抑制剂水蛭素（Hirudin），也在人血清实际样品中通过标准添加的方法成功检测了凝血酶活性。同时Ni2+-NTA MNPs的可重复利用性也说明这是一种简单、灵敏、经济的凝血酶活性检测方法，并有望于应用在抗凝药物的筛选中。2、通过酶切完整表达的绿色荧光蛋白，我们获得了去除第十β片段（S10）后具有成熟发光基团的绿色荧光蛋白大片段（truncated GFP）。在用胰蛋白酶酶切完整绿色荧光蛋白后，分别使用盐酸胍、SDS、尿素变性分离truncated GFP和S10，评估这三种变性剂的变性及随后的分离效果，以及得到的大片段truncated GFP与合成的S10片段混合后的荧光恢复情况。3、基于第2个工作中构建的自组装双分子荧光互补对truncated GFP和S10，并用多肽合成方法在S10的C端融合cAMP依赖蛋白激酶（cAMP-dependent proteinkinase, PKA）的识别多肽，我们首次将自组装双分子荧光互补技术用以检测蛋白激酶PKA的活性。由PKA介导的S10C端的磷酸化阻止了羧肽酶Y（carboxypeptidaseY, CPY）对S10片段的切割，从而保持了S10的完整性，使其能和truncated GFP复合，形成完整的荧光蛋白，恢复荧光。因此通过反应液中荧光恢复的程度可以检测体系内PKA的活性。