论文部分内容阅读
棉铃虫（Helicoverpa armigera）属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性的重要农业害虫，在我国为常发性害虫。防治棉铃虫所使用的大多数化学农药对环境和人类健康有害，而目前开发的转基因抗虫作物的安全性也存在某些争议。因此在理论研究的基础上，开发新型生物农药一直是害虫防治的研究热点。
基因沉默(RNAi)技术作为新兴的生物技术，已经越来越多地应用到生命科学的各个领域，植物保护学也试图将其应用到农业害虫的防治上。目前大多数昆虫RNAi是应用喂食和注射的方法来研究的，也有报道通过转基因的方式，使植物表达害虫基因的双链RNA（dsRNA），从而干扰取食这些转基因植物害虫的基因，实现控制害虫危害的目的。但是，要应用RNAi技术进行重要农业害虫的防治，为现代植保提供一条具有广阔发展前景的害虫防控新途径，首先必须通过基础研究，解决害虫RNAi的效率和安全性问题。
本文研究了dsRNA对棉铃虫基因的干扰及其毒理学效应，比较了几种不同dsRNA递送方法诱导的基因沉默效应，确定了最高效的dsRNA递送方法和最敏感的棉铃虫基因沉默检测参数;比较了不同基因的沉默效应;分析了影响基因沉默效应的dsRNA特征，为设计高效dsRNA奠定了理论基础;比较了在不同条件下dsRNA的降解速率，揭示了dsRNA在昆虫体内的降解规律，以及注射和喂食dsRNA产生不同沉默效应的原因，为选择有效的dsRNA递送方法提供了理论依据。现将具体研究结果总结如下:
1.利用简并引物，采用巢式PCR等分子生物学技术对棉铃虫的蜕皮激素受体（EcR）和超气门蛋白（USP）的基因片段进行克隆，并对序列进行了分析。结果显示，克隆得到的两个基因片段EcR-501和USP-600与其他鳞翅目昆虫的这两个基因有高达80％～90％的相似性，表明克隆得到的基因片段是棉铃虫蜕皮激素受体和超气门蛋白基因序列。随后又参照NCBI中新登录的蜕皮激素受体序列以及登录的几丁质酶(Chi)全长序列和热激同源蛋白70（Hsc70）全长序列设计特异引物，克隆了棉铃虫蜕皮激素受体上的另一个片段EcR-347;几丁质酶上的四个片段:Chi，Chi-2，Chi3和Chi3-2以及热激同源蛋白70上的一个片段Hsc70-352。测序后与NCBI数据库中登录的序列进行比对，显示克隆的这6个基因片段均为目标基因片段。这些基因片段的成功克隆为下一步基因沉默试验奠定了基础。
2.通过构建dsRNA表达载体，以及发酵条件的优化，建立了体外dsRNA合成的菌液发酵技术。发现当细菌发酵液的OD600为4.0时，加入IPTG至终浓度0.25mM进行诱导，继续摇菌5小时，为dsRNA生产最佳培养程序。
3.比较了注射dsRNA、喂食dsRNA和喂食表达dsRNA的细菌液3种dsRNA递送方法介导的基因沉默效应。结果表明单次注射dsRNA的棉铃虫幼虫死亡率与对照没有显著差异，但试虫化蛹成功率降低了42.5％，发育异常率提高了6.4倍。单次喂食dsRNA没有显著的表现型差异，但连续喂食dsRNA的基因沉默效应显著，不仅试虫的化蛹成功率下降了41.7％，发育异常率提高了4.9倍，同时幼虫死亡率也升高了3.5倍。同样，连续喂食表达dsRNA的细菌液，也可以使棉铃虫产生显著的基因沉默效应，喂食表达dsUSP细菌液的处理组试虫的化蛹成功率(27.1％)比dsEGFP细菌液处理的对照试虫的化蛹成功率(86.1％)显著降低，幼虫死亡率(41.7％)是对照组(11.1％)的3.8倍，试虫的发育异常率(31.3％)是对照组(2.8％)的11.2倍。定量PCR检测发现，连续喂食dsUSP细菌液120小时后，棉铃虫超气门蛋白基因的表达量下降为对照的40.3％。综合比较分析发现，dsRNA不同递送方法中，以连续喂食表达dsRNA的细菌液介导的昆虫基因沉默效应最显著，而且操作简便，成本低廉。此外，比较不同观测指标检测棉铃虫基因沉默的效应发现，处理试虫的发育异常率是最敏感的检测参数，其次为化蛹成功率，幼虫死亡率的敏感性相对较差。
4.本研究利用表达dsRNA的细菌液，连续喂食棉铃虫，比较不同基因的沉默效应。结果显示，喂食表达dsHsc70细菌液的处理组试虫热激同源蛋白70基因的表达量为对照的115％，没有显著差异，试虫的生长发育也没有显著变化。但喂食表达dsChi-2和dsEcR细菌液的棉铃虫几丁质酶和蜕皮激素受体基因的表达量分别下降到对照的37.2％和80.3％，且化蛹成功率也显著降低，分别为对照的53.2％和79.1％。此外，本研究还发现，喂食表达dsChi-2细菌液的棉铃虫体重增长缓慢，幼虫死亡率(49.3％)显著高于对照(11.1％)，但发育异常率没有显著变化。而喂食表达dsEcR细菌的试虫发育异常率(14.6％)显著高于对照(2.8％)，但体重增长速率和幼虫死亡率与对照没有显著差异。由此可知，在RNA干扰研究中，并不是所有的被干扰基因都会表现出明显的沉默效应;并且在相同dsRNA浓度下，不同基因的dsRNA在同一昆虫中并不一定都能产生相同的表型沉默效应。因此，为了获得显著的沉默效应，靶基因的选择至关重要。本研究还表明棉铃虫几丁质酶基因和蜕皮激素受体基因可以作为RNAi防治害虫的靶基因，为农业害虫无公害治理提供了重要的基因资源。
5.以棉铃虫几丁质酶为目标基因，研究了dsRNA的剂量、位置和长度三个特征对沉默效应的影响，结果显示，在一定范围内提高dsRNA剂量能提高基因沉默效应，而超过了一定剂量后，即使继续提高dsRNA剂量也不会对沉默效应产生显著影响。dsRNA靶向位置试验结果表明，无论是靶向基因的编码区还是UTR区，dsRNA都能抑制靶基因的表达，只是位置不同抑制程度有明显差异，但这种差异与dsRNA靶向位置没有固定的关系。dsRNA长度对沉默效应的影响试验表明，大于50bp的dsRNA均能有效地沉默靶基因，且不同长度dsRNA的沉默效应没有显著差异。但当dsRNA的长度缩短至25bp时，则无法对靶基因产生显著的沉默效应。本研究结果为设计高效的dsRNA提供了理论依据。
6.本研究探讨了不同递送方法对dsRNA稳定性的影响，发现dsRNA在血淋巴中被快速降解成小分子dsRNA，但这种小分子dsRNA能相对稳定地存在于血淋巴中。中肠液对dsRNA的降解速率比血淋巴快，尤其是饥饿处理的棉铃虫中肠液更容易降解dsRNA。但试验发现细菌细胞壁能有效地保护dsRNA不被中肠液降解。此外，研究还发现中肠液对不同长度的dsRNA的降解速率是不同的，对短的dsRNA的降解速率显著高于长的dsRNA。本研究结果为选择有效的dsRNA递送方法提供了理论依据。