宫颈癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。近年来，宫颈癌三阶梯筛查的逐渐普及、人们生活水平的不断提高和妇女保健意识的不断增强使得许多宫颈癌患者得以早期发现和诊治，但是传统的手术治疗往往会使患者的生殖器官遭受严重损害，影响生育能力及其性功能。严重威胁着患者，尤其是年轻患者的身心健康。虽然现在手术治疗的观念正向保证疗效的同时尽量缩小组织创伤的方向转变，但是保留生育功能的手术方式有严格的手术适应症，且术后妊娠率低，妊娠后发生流产、早产的风险亦较大。面临这一新的问题，我们希望找到一种能有效杀死肿瘤细胞保证疗效的同时减少甚至不损害患者的生殖器官以保存患者生育功能及性功能的新的安全的无创治疗方法。脉冲电场（Pulsed Electric Fields, PEF）是近年逐步发展起来的肿瘤治疗新方法，不同脉宽的PEF可分别导致细胞发生可逆性穿孔（Reversible Electroporation，RE）、不可逆性穿孔（Irreversible ElectricalBreakdown, IREB）和细胞内处理效应（Intracellular Electromanipulation，IEM）等。然而，微秒（Microsecond，μs）和纳秒(Nanosecond, ns)级脉冲电场的引入需要将有创或微创的电极阵列穿刺插入肿瘤组织，这种方式无疑给操作带来不便、给患者带来一定的不适，同时可能造成肿瘤细胞的扩散转移等，因而在一定程度上限制了此方法的应用。当脉冲电场的场强上升至数百甚至上千kV/cm、脉宽为皮秒级（即皮秒脉冲电场，Picosecond Pulsed Electric Fields, psPEF）时，其具有丰富的超宽带频谱，时间和空间分辨率高，信号失真小。重庆大学输配电装备及系统安全与新技术国家重点实验室研制的超宽带冲激脉冲辐射天线（Impulse radiating antenna，IRA）在特定范围内传输能量，将脉冲电磁波汇聚在指定区域,摧毁目标,在时间和空间上，辐射能量都很集中。通过匹配IRA，有可能实现psPEF无创进入生物组织并精确靶向聚焦继而发挥特殊的生物效应。近几年，本课题组与该实验室合作，期望找到一种新的肿瘤物理治疗方法。2011年，合作单位对psPEF发生器进行性能改进，目前该psPEF发生器可产生达600kV/cm的电场强度，具有稳定的放电性能，可以通过IRA进行能量聚焦，使无创有效治疗肿瘤成为可能。但是现国内外对psPEF的相关研究较少，尚处于基础阶段，本课题组近几年对psPEF对肿瘤细胞的生物学作用进行研究，以期为早期宫颈癌患者找到一种无创、有效、安全、保留生育功能的新方法。本实验将以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象，给予不同参数的psPEF处理，应用MTT法、流式细胞计数法（flow cytometry，FCM）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）检测细胞增殖、凋亡及坏死情况，探讨psPEF的不同参数与细胞增殖、凋亡及坏死的关系，为后续的动物实验参数筛选及临床研究提供依据。第一部分皮秒脉冲电场对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响及其量效关系研究目的:探讨psPEF对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响及其剂量-效应关系。方法:实验分组：根据psPEF电场强度的不同将HeLa细胞分为7组：对照组及6个不同电场强度组（100kV/cm组，200kV/cm组，300kV/cm组，400kV/cm组，500kV/cm组，600kV/cm组），各场强组根据脉冲处理后培养时间的不同进一步分为6h、12h、24h、36h、48h5个亚组，各实验组psPEF的其它参数固定为：脉宽800ps，频率3Hz，脉冲个数2000个。MTT法检测各组细胞增殖情况。根据前面MTT实验结果，后续试验中脉冲处理后细胞培养时间均为12h。在MTT检测psPEF不同电场强度及脉冲个数与细胞增殖抑制的关系实验中分组为：根据psPEF电场强度的不同将HeLa细胞分为7组：对照组及6个不同电场强度组（100kV/cm组，200kV/cm组，300kV/cm组，400kV/cm组，500kV/cm组，600kV/cm组），各场强组根据脉冲个数的不同分别进一步分为1000、2000、30003个亚组，各实验组psPEF的其它参数固定为：脉宽800ps，频率3Hz。各组于处理后12h以MTT法检测各组细胞增殖情况。此实验得出的结果中电场强度为200kV/cm、400kV/cm组、600kV/cm组时细胞增殖受抑制情况尤其明显，因此后续试验选择此三点作为低-中-高电场强度参数。根据前面实验结果，在流式细胞仪检测细胞周期分布的实验中分组为：根据psPEF电场强度的不同将HeLa细胞分为4组：对照组及3个不同电场强度组（200kV/cm组，400kV/cm组，600kV/cm组），各实验组psPEF的其它参数固定为：脉宽800ps，频率3Hz，脉冲个数2000个。作用后12h，流式细胞仪检测各组细胞周期的分布。结果: psPEF处理HeLa细胞后，与对照组相比，各实验组细胞增殖受到明显的抑制（P<0.05），同一实验组的细胞在处理后12h的增殖抑制率高于处理后6h（P<0.05），12h、24h、36h、48h各时间点两两比较差异无统计学意义（P>0.05）。在脉冲个数相同的各场强组中，随着脉冲场强的升高，细胞增殖抑制率增加；在各场强相同的脉个数组中，细胞增殖抑制率随着脉冲个数的增加而增加；在电场强度为600kV/cm、脉冲个数为时3000个细胞抑制率最高。流式细胞仪检测皮秒脉冲电场处理后的HeLa细胞周期分布显示：实验组中处于G2/M期的细胞数较对照组多；在各实验组中，随着场强的升高，处于G2/M期的细胞数逐渐增多。结论:一定剂量（电场强度100kV/cm~600kV/cm；脉冲个数1000~3000）的皮秒脉冲电场能抑制HeLa细胞增殖，将细胞周期阻滞在G2/M期。psPEF对细胞增殖抑制作用在处理后12h达最大值，该效应与场强、脉冲个数成正相关，在psPEF的场强为600kV/cm、脉冲个数为3000个时，细胞抑制率最高。第二部分皮秒脉冲电场对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和坏死的影响及其量效关系研究目的:探讨不同参数的psPEF对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和坏死的影响及其剂量与效应的关系。方法:根据第一部分实验结果，分组如下：分组方案一为对照组及3个不同电场强度组（200kV/cm组，400kV/cm组，600kV/cm组），各实验组psPEF的其它参数固定为：脉宽800ps，频率3Hz，脉冲个数2000个。于作用后12h以透射电子显微镜观察对照组和各实验组细胞的超微结构，流式细胞仪检测各组细胞凋亡及坏死情况；分组方案二为对照组及3个不同脉冲个数组（1000组，2000组，3000组），各实验组psPEF的其它参数固定为：脉宽800ps，频率3Hz，电场强度400kV/cm。于作用后12h以流式细胞仪检测各组细胞凋亡及坏死情况。结果: psPEF作用于HeLa细胞后，透射电子显微镜下观察到各实验组细胞呈典型的凋亡形态以及细胞器肿胀；流式细胞仪检测到实验组细胞的凋亡率较对照组明显增加，实验组中400kV/cm组高于200kV/cm组（P<0.05），600kV/cm组高于400kV/cm（P<0.05）；2000组高于1000组（P<0.05），3000组高于2000组（P<0.05），而相邻两组间细胞晚期凋亡及坏死率比较差异不明显（P>0.05）。结论:一定剂量（电场强度100kV/cm~600kV/cm；脉冲个数1000~3000）的皮秒脉冲电场可诱导HeLa细胞发生凋亡，且与场强、脉冲个数成正相关。