松树萎蔫病（Pine Wilt Disease,PWD）又称松材线虫病,是一种毁灭性森林病害,在东亚和欧洲部分地区发生为害严重。近年该病在我国的疫情不断扩展蔓延,已经造成了巨大的经济损失和生态威胁,其病原松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）被我国评定为一级危险性林业有害生物。由于松材线虫病的发生发展过程复杂,其致病机理仍未明确,防治十分困难。阐明松材线虫如何克服环境变化和松树防御反应而成功侵染定殖于树体的分子机制对有效防控松材线虫病具有十分重要的意义。细胞自噬是真核生物为应对环境应激而进化出的一种由一系列自噬基因调控的保护性机制,其通过降解胞内组分以维持生理平衡和内环境稳态,在生物体的生长发育、免疫防御等生理和病理过程中都具有重要的作用。然而目前关于病原松材线虫细胞自噬的研究甚少。为此本文对细胞自噬在松材线虫侵染寄主和适应环境变化过程中的作用进行了探讨,以期促进对松材线虫致病机制和生态适应机理的阐明。主要研究结果如下:1.通过蛋白质免疫印迹分析比较自噬标志蛋白BxATG8-II与BxATG8-I表达量的变化,建立了定量检测松材线虫细胞自噬活性的方法。检测自噬活性是研究自噬的基础。本研究首先通过同源重组构建松材线虫自噬标志蛋白BxATG8的原核表达载体pET-28a（+）-BxATG8,将其转入表达感受态细胞异源表达该蛋白,大量诱导表达后通过Ni-NTA agarose纯化得到重组蛋白BxATG8;使用该蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,纯化浓缩后得到BxATG8多克隆抗体,通过间接ELISA检测其效价高达1:512,000,Western blot分析证明该抗体能够同时识别松材线虫自噬标志蛋白BxATG8两种形式的蛋白:BxATG8-I和BxATG8-II。使用自噬抑制剂3-Methyladenine（3-Ma）处理松材线虫后,检测线虫的自噬活性即蛋白表达量比值BxATG8-II/BxATG8-I的大小,发现自噬抑制剂3-Ma确实显著降低了松材线虫的自噬活性,表明定量检测松材线虫自噬活性的方法成功建立,为进一步的研究提供了科学手段与技术支持。2.通过PCR克隆得到松材线虫中3个新的自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16,对其编码蛋白的系统进化与结构进行了生物信息学分析。研究发现,松材线虫这3个自噬蛋白与已知的其他物种中的这3个蛋白有一定的相似度,但亲缘关系都较远;这3个蛋白均偏酸性,且都是亲水性蛋白,其中BxATG5和BxATG16无信号肽,BxATG9存在信号肽且含有5个跨膜区,属于典型的跨膜蛋白;对这3个蛋白的三级结构模型进行了预测,结果显示其中的BxATG16蛋白不存在空间折叠,推测可能与其特定的功能相关。3.通过RNA干扰对松材线虫自噬基因BxATG9和BxATG16的功能进行了验证分析。研究发现,自噬基因BxATG16正向调控BxATG5的转录表达;高效沉默BxATG9和BxATG16后,对松材线虫的细胞自噬活性、虫体形态、运动能力、取食速度和繁殖量进行了测定,结果显示这两个自噬基因的沉默都能导致松材线虫的自噬活性明显降低;并且都显著抑制了松材线虫在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）上的取食速度和繁殖量,但不影响线虫的形态和运动能力。表明这两个基因在松材线虫的自噬过程中具有重要作用,并参与调控了线虫的取食繁殖过程。4.通过qRT-PCR检测了松材线虫在受到松树主要防御物质之一的α-蒎烯的胁迫和侵染寄主松树的过程中自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16的表达模式。结果显示,这3个自噬基因的相对表达水平都在松材线虫遭受α-蒎烯胁迫4 h时以及松材线虫侵染松树后其病程的整个发展过程中（发病前期、初期、后期和病树死亡）显著增强,表明自噬很可能在松材线虫的防御与致病过程中起着关键的作用。5.同源克隆得到黑松（Pinus thunbergii）中两个调控活性氧（Reactive oxygen species,ROS）合成的关键基因呼吸爆发氧化酶基因PtRBOH1和PtRBOH2的保守结构域,通过qRT-PCR分析了黑松中这两个基因在松材线虫侵染早期（0.5、1、2、3和4 d）的表达模式,并测定了接种点附近的松树茎干中ROS主要产物H₂O₂含量的变化。结果发现黑松ROS在基因和代谢水平都响应了松材线虫的侵染。同时对松材线虫侵染早期3个自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16的表达模式进行了检测,结果显示这3个基因上调表达的时间与受侵染松树中H₂O₂含量达到峰值的时间相同,且它们的表达水平随H₂O₂含量的显著下降而明显降低,表明侵染早期松材线虫自噬基因的表达与松树ROS代谢相关。接着通过qRT-PCR、透射电子显微镜的观察和Western blot定量分析,发现H₂O₂引起的氧化胁迫使松材线虫自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16的表达明显提高,使松材线虫细胞中自噬前体、自噬体、自噬溶酶体这些典型的自噬结构的数量增加,使松材线虫的自噬活性显著增强,表明氧化胁迫诱发了松材线虫的细胞自噬。6.通过自噬抑制剂3-Ma的应用和自噬基因BxATG9和BxATG16的沉默,双重验证了自噬在松材线虫抗氧化过程中的重要性。结果表明,在氧化胁迫下自噬不影响松材线虫的形态和运动能力,但对线虫的取食、繁殖、卵孵化和存活至关重要,自噬是松材线虫抗氧化过程中不可或缺的一个环节。同样通过上述两种方法,双重验证了自噬在松材线虫侵染寄主过程中的重要性。结果显示,抑制线虫的自噬显著降低了线虫在树体中的繁殖量,明显推迟了寄主松树的发病时间和死亡时间,严重阻碍了松材线虫病的发展。表明自噬影响着松材线虫的毒力,在线虫的致病过程中具有关键的作用。结合前面的结果,可以认为:当松材线虫的自噬被阻塞时,松树中ROS代谢产生的氧化胁迫环境会大幅度减少线虫的取食速度和繁殖量,并严重抑制其卵孵化和存活,从而导致树体内线虫数量显著降低,进而明显延缓了松树的萎蔫进程。7.使用自噬抑制剂3-Ma和沉默自噬基因BxATG9和BxATG16抑制了松材线虫的自噬后,对侵染黑松早期（1、2和3 d）线虫中过氧化物酶基因BxPrx与过氧化氢酶基因Bxy-ctl-1和Bxy-ctl-2的表达模式进行了检测,发现这3个抗氧化基因的表达水平都显著上调,尤其在第3 d,表明松材线虫在侵染早期很可能通过提高过氧化物酶和过氧化氢酶这两条抗氧化通路的水平来减少自噬受抑引起的氧化损伤。8.温度是影响松材线虫病发生发展主要的环境因子,探讨了温度对松材线虫的取食繁殖和运动能力的影响及线虫对温度变化的适应机制。研究发现松材线虫在灰葡萄孢上的取食速度、繁殖量和运动能力在15°C的低温条件下被严重抑制,而在35°C的高温条件下被显著提高。同时通过定量Western blot和qRT-PCR测定了线虫的自噬活性和自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16的相对表达水平,结果显示15°C低温诱发了松材线虫的细胞自噬,35°C高温下线虫的自噬水平较低。通过自噬抑制剂3-Ma抑制了松材线虫的自噬活性后,对15°C低温条件下线虫在灰葡萄孢上的取食繁殖和运动能力进行了测定,发现自噬的抑制显著降低了低温下松材线虫的取食速度、繁殖量和运动能力,表明自噬参与调控松材线虫在低温下的取食繁殖和运动过程,自噬在线虫抵御低温胁迫时至关重要。本文证实细胞自噬在松材线虫侵染寄主和响应温度变化的过程中具有重要的作用,自噬通过抵御寄主活性氧代谢产生的氧化胁迫促进了松材线虫的侵染,并且有助于线虫在低温下的取食、繁殖和运动。该研究有助于阐明松材线虫的防御与致病机理及适应环境变化的分子机制,并为松材线虫病的防控提供了可能的靶标和理论依据。