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组织蛋白酶D(Cathepsin D)是许多真核生物细胞中广泛存在的一种溶酶体天冬氨酸蛋白酶,可以降解胞内和胞外蛋白质。金属基质蛋白酶2(Matrix metalloproteinase,MMP2)是一种锌依赖性蛋白内切酶,可以降解细胞外基质,它们在生物机体的病理过程中都发挥着重要作用。罗非鱼是我国重要的淡水养殖鱼类。本研究采用其作为实验对象,采用RACE、分子克隆以及荧光定量PCR技术等技术,对Cathepsin D基因与MMP2基因进行了克隆、功能预测与组织表达分析等。主要的研究结果如下:(1)获得了罗非鱼Cathepsin D基因全长c DNA序列,长为1642bp,包括57bp的5′UTR、394bp的3′UTR和1191bp的编码区。1191bp的编码区共编码396个氨基酸,包括1-18氨基酸组成的信号肽区、19-46氨基酸组成的前导肽区以及47-396氨基酸组成的成熟肽。Cathepsin D基因蛋白质前体的理论等电点为6.1,分子量为43.2KD,成熟蛋白的理论等电点为5.52,分子量为38KD。成熟蛋白的不稳定系数(instability index(II))为34.24,属于一种稳定的蛋白,其脂肪指数(Aliphatic index)为79.09,总平均疏水指数(Grand average of hydropathicity(GRAVY))为-0.114,属于亲水性差脂溶性强的蛋白。通过氨基酸序列分析发现罗非鱼cathepsin D基因在各物种之间比较保守,罗非鱼与尖吻鲈的同源性高达89%。与大多数硬骨鱼不同,罗非鱼cathepsin D蛋白的131、249和314氨基酸处存在3个N-glycosylation(N-X-S/T)位点。本研究还克隆获得了罗非鱼cathepsin D基因序列全长,为7628bp,通过对罗非鱼cathepsin D基因序列与cDNA序列比对发现罗非鱼cathepsin D基因结构与斑马鱼类似,都是由9个外显子区和8个内含子区构成。(2)通过克隆得到了3033bp的MMP2基因片段,包含95bp的5′UTR、967bp的3′UTR以及1971bp的编码区。1971bp的编码区共编码656个氨基酸,包括1-29氨基酸处的信号肽区,43-97氨基酸处的前导肽区以及98-656氨基酸处的成熟肽。成熟的MMP2蛋白包括催化区、铰链区和羧基末端区,催化区含有3个纤维连接蛋白Ⅱ型结构域,羧基末端区含有四个类血红素结合蛋白重复。MMP2基因蛋白质前体的理论等电点为5.01,分子量为74.33KDa。成熟的MMP2蛋白的理论等电点为4.91,分子量为70.99KDa,不稳定系数为29.16,属于一种稳定的蛋白,其脂肪指数为57.11,总平均疏水指数为-0.529,属于亲水差的蛋白。通过氨基酸序列分析发现MMP2基因在脊椎动物间比较保守,其中罗非鱼与红鳍东方鲀的同源性高达89%。(3)实时荧光定量PCR分析结果表明,cathepsin D基因在健康罗非鱼12个组织中都有表达,但它们的表达量差异显著(P<0.05)。在头肾和脾中表达量较高,肠、脑和血液中次之,心、鳍、眼、肌肉、性腺、肝中表达量较低,头肾的表达量约为心的13倍,脾的表达量约为心的7倍。对罗非鱼进行人工攻毒嗜水气单胞菌后,cathepsin D基因的表达量在脾、肠、肝和头肾中均发生了上调,分别在5h、24h、48h和48h到达峰值,并随后开始下降。MMP2基因在健康罗非鱼11个组织中均有表达,但表达量有显著差异(P<0.05)。在雄性中的精巢、心和眼中表达量较高,肌肉和鳍次之,肝脏中较低。精巢的表达量约为肝的14.47倍,心和眼的表达量分别为肝的8.12倍和7.04倍。人工使罗非鱼感染嗜水气单胞菌后MMP2基因在脾、头肾和肝中的表达量发生明显上调,分别在5h、24h和48h到达峰值,随后也开始下降,并渐渐趋于正常水平。研究结果说明,随着外来致病菌的入侵,免疫相关器官内cathepsin D和MMP2基因表达量发生先升后降的显著变化,可能与机体启动清除致病菌的过程有关,说明cathepsin D和MMP2基因在罗非鱼天然免疫过程中发挥着重要作用。