论文部分内容阅读
自20世纪80年代以来,由非结核分支杆菌(NTM)引发的疾病病例增长迅速,逐步引发了人们对NTM研究的重视。在这些NTM中,鸟分支杆菌(Mycobacterium avium,M.avium)是全球范围内引起人和动物疾病最常见的病原菌之一。所以准确鉴定鸟分支杆菌亚种,对于评估其致病性和流行病学特征至关重要。M.avium的四个亚种中,副结核亚种(M.avium subsp.paratuberculosis,MAP)对畜牧业威胁最大,其主要引起反刍动物的慢性肉芽肿性肠炎,给肉牛及奶牛养殖带了较大的经济损失。在MAP感染过程中,巨噬细胞发挥着重要作用,MAP可以在巨噬细胞中存活,增殖和传播。目前,有关巨噬细胞在MAP感染后所引起的免疫应答机制尚未完全阐明。因此,本试验以M.avium为研究对象,对M.avium菌株进行亚种鉴定;进而对体外分离的牛单核-巨噬细胞受副结核亚种侵染后的mRNA及miRNA表达谱进行了测序分析,最后对筛选出的miRNA-150靶向PDCD4(程序性细胞坏死因子4)基因调节巨噬细胞的凋亡机制进行了探究。主要研究结果如下:1.M.avium亚种鉴定及比较基因组分析通过对鸟分支杆菌插入序列IS1311,IS900,IS901的检测及高度保守的抗原基因85B单核苷酸多态性分析完成了对菌株HJW和P10的亚种鉴定,其中菌株HJW为森林亚种(M.avium subsp.silvaticum,MAS),P10为MAP。进而对罕见的森林亚种HJW进行了全基因组测序及分析,获得了0 gap的完整基因组序列,其基因组中包含丰富的遗传信息,包括多个重复序列,基因岛及分支杆菌典型的VII型分泌系统等。结合测序结果,对Genebank中已登录的M.avium全基因组序列进行比较分析,其中系统发育分析表明菌株HJW与另一中国分离株M.avium RCAD0278密切相关,共属同一分支。毒力因子PE/PPE家族分析表明,除PPE41,PPE42基因为副结核分支杆菌特有外,其它基因分布并无明显特异性。2.MAP体外侵染牛单核-巨噬细胞mRNA表达谱分析通过高通量测序技术对MAP侵染后的牛单核-巨噬细胞与未侵染细胞进行了mRNA表达谱分析,共筛选出显著差异表达基因618个,其中上调基因322个,下调基因296个。差异基因可显著富集到145个GO功能组,包括细胞因子活性,趋化因子活性,炎症反应,凋亡过程等多个与巨噬细胞免疫应答反应相关功能组;可显著富集到54个KEGG信号通路,包括NF-κB,MAPK,TOLL样受体,IL-17等多个与激活巨噬细胞免疫应答相关的信号通路。此外,使用qRT-PCR技术对测序结果进行验证,证明了测序结果的准确性。3.MAP体外侵染牛单核-巨噬细胞miRNA表达谱分析通过高通量测序技术对MAP侵染后的牛单核-巨噬细胞与未侵染细胞进行了miRNA表达谱测序分析,共筛选出差异表达miRNA 68个,其中已知牛miRNA40个,其它物种miRNA 21个,预测为novel miRNAs 7个;上调miRNA 37个,下调miRNA 31个。结合mRNA表达谱研究,对已知牛miRNA靶基因进行预测,对具有负调控关系的靶基因进行了功能分析。结果显示,靶基因可富集到多个与激活巨噬细胞免疫应答相关的信号通路,结合miRNA与mRNA表达谱分析,构建了相关信号通路的miRNA-mRNA调控网络。此外,使用茎环法对miRNA测序结果进行qRT-PCR验证,证明了结果的准确性。4.miRNA-150靶向PDCD4基因调控巨噬细胞凋亡作用研究首先,成功构建了PDCD4基因过表达载体并转染到RAW264.7细胞中,通过流式细胞术确认PDCD4基因对巨噬细胞具有促凋亡作用。随后通过双荧光素酶报告试验对miR-150与PDCD4基因的靶向关系进行了确证。进而结合流式细胞术与western blot等方法,对miR-150模拟物(mimics)及抑制物(inhibitor)靶向PDCD4基因调控巨噬细胞凋亡作用进行确证。最后,通过siRNA与miR-150inhibitor共转染细胞后的凋亡检测进一步证明,miRNA-150可以通过靶向PDCD4基因调控巨噬细胞凋亡。综上所述,本研究为阐明MAP的致病机理及其诱导的巨噬细胞免疫应答机制提供了理论基础,同时为miRNA调控巨噬细胞凋亡机制的研究提供了参考依据。