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第一部分:异位子宫内膜中Notch信号通路关键分子表达的研究目的:研究Notch信号通路相关分子NOTCH1,JAG1以及NOTCH1活性片段N1ICD在内异症在位和异位子宫内膜中的表达,明确Notch信号通路与内异症的关系。方法:1.各收集20例明确诊断为内异症患者的增生期子宫在位内膜及异位内膜组织,以单纯输卵管因素不孕妇女增生期子宫内膜组织(20例)为对照。免疫组织化学染色法(IHC)检测Notch信号通路相关分子NOTCH1,JAG1和以及N1ICD在各组子宫内膜组织中的定位和表达。2.Western blot检测各组子宫内膜组织NOTCH1和JAG1以及N1ICD的表达。结果:1.子宫内膜中Notch信号通路相关分子在细胞内的定位情况:①NOTCH1和JAG1均表达于子宫内膜腺上皮细胞的细胞膜,而在间质细胞内的表达量较少;②子宫内膜上皮细胞和间质细胞中均存在N1ICD的表达。在正常和在位内膜中,N1ICD主要位于上皮细胞的细胞浆,而在异位内膜中,则主要表达于上皮和间质细胞的细胞核。2.Notch信号通路相关分子在子宫内膜的表达情况:与正常子宫内膜和内异症在位内膜相比,内异症异位子宫内膜NOTCH1和JAG1以及N1ICD表达显著增加,而在正常子宫内膜和内异症患者在位内膜中,这三种蛋白在两组间的表达无显著差异。结论:1.NOTCH1和JAG1以及N1ICD在内异症患者异位子宫内膜表达明显增高,表明Notch信号通路可能参与了内异症的发病。2.NOTCH1和JAG1以及N1ICD在内异症异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞中的表达和定位不一致,提示Notch信号通路可能对内异症上皮和间质细胞发挥着不同的调控作用。第二部分:雌激素介导Notch信号通路促进子宫内膜异位症上皮间质转化的研究目的:1.分析EMT相关分子在内异症患者在位和异位子宫内膜中的表达情况,验证异位子宫内膜是否发生EMT现象。2.研究雌激素是否能促进子宫内膜上皮细胞Notch信号通路相关分子的表达和EMT的发生;3.研究雌激素受体(ER)在雌激素促进子宫内膜上皮细胞Notch信号通路相关分子的表达和EMT发生中的作用;4.研究Notch信号通路在雌激素促进子宫内膜上皮细胞EMT发生中的作用。方法:1.分离培养人原代子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cell,EECs)并进行细胞鉴定;2.利用第一部分的标本,采用连续性切片进行免疫组化染色,检测EMT相关分子(E-cadherin和Vimentin)在正常子宫内膜、在位和异位子宫内膜中的定位和表达。3.17β-雌二醇(10-8M)作用 EECs 不同时间(0h,12h,24h),Western blot检测Notch信号相关分子(NOTCH1、JAG1及N1ICD)以及EMT相关分子标志物(slug,E-cadherin和Vimentin)的表达,利用相差像显微镜镜下观察EECs形态改变,Transwell检测EECs迁移和侵袭能力改变;4.雌激素拮抗剂ICI阻断EECs雌激素受体,再给予17β-雌二醇刺激,Western blot检测Notch信号相关分子以及EMT相关分子的表达,相差显微镜观察EECs形态改变,Transwell检测EECs迁移和侵袭能力改变;5.Notch信号阻断剂DAPT作用于EECs,再给予17β-雌二醇刺激,Western blot检测Notch信号相关分子以及EMT相关分子的表达,相差显微镜观察EECs形态改变,Transwell检测EECs迁移和侵袭能力的改变;结果:1.成功分离EECs,细胞纯度和阳性率均高于95%。2.异位子宫内膜中E-cadherin的表达较正常内膜明显下降,Vimentin的表达较正常内膜明显升高;而二者在在位内膜中的表达与正常内膜相比无显著性差异。3.雌激素体外能促进EECs中Notch信号相关分子NOTCH1、JAG1和N1ICD以及Vimentin和Slug表达,降低E-cadherin表达,并呈时间依赖性;相差显微镜下EECs生长较为分散,细胞接近纺锤状,纤维样的形态;Transwell实验结果显示EECs侵袭与迁移能力明显增强。4.ICI阻断EECs雌激素受体后,雌激素诱导的Notch信号通路相关分子的表达明显下降,EMT现象出现逆转。5.DAPT抑制EECs Notch信号通路后,雌激素诱导的EMT现象亦发生逆转。结论:1.内异症患者的异位内膜的上皮细胞发生了 EMT;2.雌激素通过其受体激活EECs中的Notch信号通路,进一步促进EMT发生,从而参与内异症的侵袭和转移。3.阻断Notch信号通路或将成为阻碍子宫内膜异位症发生和发展的新策略。第三部分:雌激素介导Notch信号通路在内异症子宫内膜间质细胞侵袭转移过程中的作用及机制目的:1.研究在雌激素促进子宫内膜间质细胞侵袭转移过程中Notch信号通路的作用;2.阐明内异症中雌激素是否通过ER α激活Notch信号通路及其具体机制。方法:1.分离培养人原代子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cell,ESCs)并进行细胞鉴定;2.17β-雌二醇(10-8M)作用ESCs不同时间(0h,12h,24h),Western blot检测Notch信号相关分子(NOTCH1和JAG1和N1ICD)以及MMP9和VEGF的表达,免疫荧光和免疫细胞化学法检测N1ICD入核情况,Transwell检测ESCs迁移和侵袭能力改变;3.ICI阻断ESCs雌激素受体,再给予17β-雌二醇(10-8M)作用ESCs 24h,再次以Western blot检测Notch信号相关分子以及MMP9和VEGF的表达,以及Transwell检测ESCs迁移和侵袭能力的改变;4.构建NOTCH1shRNA转染人子宫内膜间质细胞系(HESCs),再给予17β-雌二醇刺激,Western blot检测Notch信号相关分子以及MMP9和VEGF的表达,Transwell检测ESCs迁移和侵袭能力改变。结果:1.成功分离ESCs,细胞纯度和阳性率高于95%;2.雌激素能够激活Notch信号通路,并诱导ESCs的迁移和侵袭,且这一作用呈时间依赖性;3.ICI阻断ESCs雌激素受体后,雌激素诱导的Notch信号通路相关分子以及MMP9和VEGF的表达降低;4.沉默HESCs细胞 Notch信号通路后,雌激素诱导的MMP9和VEGF表达下降;5.雌激素通过雌激素受体作用元件调控Notch信号关键分子的转录。结论:雌激素通过ERα激活Notch信号通路上调VEGF和MMP9表达,促进异位子宫内膜的迁移和侵袭。