论文部分内容阅读
目的:杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是肌营养不良性肌病中最严重的一种,是一种X连锁隐形遗传病,发病率最高,约为1/3500男婴。主要为编码dystrophin蛋白的基因发生突变,dystrophin蛋白生成缺陷,致使细胞膜结构不稳定,在外部机械力的作用下极易发生损伤,导致肌细胞坏死,伴随炎症细胞的浸润吞噬坏死细胞过程,而肌肉本身的再生修复能力不足以弥补其坏死的程度,纤维结缔组织和脂肪组织便随后替代坏死的区域。DMD的病人肌肉损伤持续性进展,无力逐渐加重,通常于20岁左右死于呼吸、循环衰竭。对于此病,目前尚无有效的治疗办法。Mdx小鼠是研究DMD的一种经典的模型鼠。此种小鼠表现为高CK血症及和人类肌营养不良相似的肌肉病理情况。对于mdx小鼠的治疗,有各种各样的方法。目前,利用载体将正常的dystrophin基因导入生物体内或修复其突变成为一大热点,但dystrophin基因过于庞大,成为这一方法的一大阻碍。近年来,很多人将目光放在肌营养不良肌病的各种症状上,利用各种生长因子,通过不同的信号途径促进肌细胞的再生,从而改善肌病的状况。胰岛素样生长因子-1（Insulin like growth factor-1,IGF-1）已成为治疗DMD的一个重要备选方向。IGF-1也被称作"促生长因子"（即somatomedin C）,是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。IGF-1在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义。它是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的产物。具有降血糖、降血脂、舒张血管等作用,同时还是人体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂,其对维持与细胞分化有关的蛋白质水平十分重要,与一些生长因子合用能促进细胞分化成熟。目前关于IGF-1对于mdx小鼠的研究,主要为两方面:一是mdx/m IGF-1转基因小鼠的观察,另一个是IGF-1蛋白对mdx小鼠的作用的研究。两种方法虽然均有效果,但第一种不适宜向临床推广,第二种在蛋白入血后有较多副作用,且需长期持续给药,操作费时费力。在本实验中,我们以腺相关病毒血清型9（Adeno-associated virus serotype 9,AAV9）为载体携带人胰岛素样生长因子-1（human insulin like growth factor-1,hIGF-1）hIGF-1基因,首先局部注射入胫前肌,观察此种方法的具体作用,其次经尾静脉注射入小鼠全身,观察是否可在全身的骨骼肌中发挥作用。方法:我们的实验分为两个阶段:首先是局部注射的方法,将病毒直接注射入小鼠右侧胫前肌,一定时间后观察;其次是通过尾静脉注射入病毒,一定时间后观察。1通过局部注射的方法观察以AAV9为载体携带hIGF-1基因是否对mdx小鼠肌肉产生作用选取4周龄、体重相近的雄性mdx小鼠8只,分为2组。4只于右侧胫前肌注射AAV9携带的绿色荧光蛋白（Green Fluorescence Protein,GFP）基因(20μl/只1×1012 vg/m L),分2点注射,每点约注射10μl,4只于右侧胫前肌注射AAV9-hIGF-1(20μl/只1×1012 vg/m L),同样分2点注射,每点约注射10μl。另选取4只4周龄、体重相近的雄性C57BL/10小鼠作为对照。8周后（即小鼠12周龄时）将小鼠麻醉后在右侧胫前肌进行肌力测试,随后摘眼球取血,留取血清样本测CK值,最后完整分离右侧胫前肌称重,并包埋,进行冰冻切片的处理,以及各种指标的检测。2通过尾静脉注射的方法观察以AAV9为载体携带hIGF-1基因是否对mdx小鼠全身骨骼肌产生作用选取6周龄、体重相近的雄性mdx小鼠6只,分为2组。3只经尾静脉注射AAV9-GFP(200μl/只1×1012 vg/ml),3只经尾静脉注射AAV9-hIGF-1(20μl/只1×1012 vg/ml)。另选取3只4周龄、体重相近的雄性C57BL/10小鼠3只作为对照。6周后（即小鼠12周龄时）将9只小鼠麻醉后取材,进行同样的评估。另同时分离两侧股四头肌、腓肠肌、肱三头肌,右侧所有肌肉包埋,进行冰冻切片的处理,随后进行各种指标的检测。应用spss13.0系统对数据进行分析。结果:1局部胫前肌注射AAV9介导hIGF-1基因过表达改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能1.1 mdx小鼠经局部胫前肌注射AAV9-GFP后,观察到其肌肉组织中有绿色荧光蛋白的表达。验证了在本实验室条件下AAV9可以成功的转染肌细胞并表达所携带的基因;1.2免疫荧光结果表明与C57BL/10组、GFP组相比,只有hIGF-1组小鼠胫前肌中表达hIGF-1;1.3 hIGF-1组、GFP组、C57BL/10组右侧胫前肌重量比较,hIGF-1组最大,为80.70±8.00mg,GFP组为58.35±4.26mg,C57BL/10组为39.93±0.81mg。各组之间差异均有统计学意义。因发现GFP组较C57BL/10组大,为验证mdx小鼠同C57BL/10肌重的区别,我们又增加一组未给任何干预的mdx小鼠,测其肌重,为60.20±2.75mg,与GFP组相比差异无统计学意义。1.4 hIGF-1组、GFP组、C57BL/10组肌肉损伤程度定量比较1.4.1血清CK水平:野生型小鼠血清CK水平为5076.67±3959.18U/L,AAV9-GFP mdx小鼠CK值为26345.64±5762.39 U/L,AAV9-hIGF-1 mdx小鼠CK值为39446.28±15905.25 U/L。mdx小鼠较正常野生型小鼠CK值均升高,但GFP组和hIGF-1组之间无明显差别;1.4.2肌肉病理:苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色中,GFP组小鼠胫前肌坏死面积较大,所占比例为6.33±2.51%,hIGF-1组小鼠胫前肌坏死面积相比GFP组有所减少,所占比例为2.14±0.43%,差异具有统计学意义;而两组再生肌纤维数目占总纤维数的百分比无明显差异;1.4.3肌力:hIGF-1组小鼠胫前肌的肌力最大,其次为GFP组,野生型小鼠肌力最小;而胫前肌的耐力测试,结果正好相反。2尾静脉注射AAV9介导hIGF-1基因过表达改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能2.1 mdx小鼠经尾静脉注射AAV9-GFP后,观察到只有胫前肌表达较多量绿色荧光蛋白,其余肌肉表达量很少;2.2免疫荧光结果表明与C57BL/10组、GFP组相比,只有hIGF-1组小鼠胫前肌中表达hIGF-1,因小鼠本身并不产生此种蛋白;2.3 hIGF-1组、GFP组、C57BL/10组右侧胫前肌重量比较,hIGF-1组最大,为75.03±4.54mg,GFP组为55.63±13.34mg,C57BL/10组为40.07±0.93mg。各组之间差异均有统计学意义。2.4 hIGF-1组、GFP组、C57BL/10组肌肉损伤程度定量比较2.4.1血清CK水平:AAV9-GFP mdx小鼠CK值为33418.57±11695.54U/L,AAV9-hIGF-1 mdx小鼠CK值为31855.8±16394.13 U/L。mdx小鼠较正常野生型小鼠CK值均升高,但GFP组和hIGF-1组之间无明显差别;2.4.2肌肉病理:HE染色中,AAV9-GFP mdx小鼠胫前肌坏死面积所占比例为6.34±2.51%,AAV9-hIGF-1 mdx小鼠胫前肌坏死面积所占比例为2.46±0.54%,较之明显减少;而中心核细胞所占比例,经计数,无统计学意义;2.4.3肌力:hIGF-1组小鼠胫前肌的肌力均大于对照组、GFP组;hIGF-1组小鼠胫前肌的耐力测试,小于C57BL/10组,大于GFP组。结论:1 AAV9携带的hIGF-1基因可在小鼠骨骼肌中成功表达;2 AAV9携带的hIGF-1基因在体内表达在病理上可促进mdx小鼠骨骼肌细胞肥大、坏死程度减轻;3 AAV9携带的hIGF-1基因在体内表达可促进mdx小鼠骨骼肌功能恢复;4 AAV9携带的hIGF-1基因在mdx小鼠体内发挥作用的具体机制,以及长期表达是否会产生副作用,仍需要我们进一步探索。