论文部分内容阅读
丙型肝炎是感染丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)引起的传染性疾病。全球估计约1.7亿人感染HCV，中国感染人数约有3700万。部分HCV感染者将发展成为慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌。因此，HCV的早期诊断显得尤为重要。HCV的实验室诊断方法主要有：抗-HCV检测、HCVAg检测、重组免疫印迹分析(RIBA)、HCV RNA检测等。其中，抗HCV检测试剂应用最为广泛。目前主流的第三代抗HCV检测试剂均采用间接ELISA，而间接ELISA普遍存在假阳性和漏检的问题。与常规抗-HCV检测方法相比，双抗原夹心ELISA法可大大提高检测的特异性和敏感性。不但能检测到IgG抗体，而且还能够检测到早期出现的IgM抗体。然而双抗原夹心ELISA试剂迄今尚未研制成功。其原因在于HCV抗原经酶标记后，形成空间位阻，阻碍了抗体与抗原的结合。因此，直接标记抗原用于建立双抗原夹心ELISA不容易成功。硫氧还蛋白(thioredoxins，TRX)是分子量为12kDa的小分子蛋白质，可在大肠杆菌中高度表达并具有高度亲水性，能为丙肝抗原可溶性表达提供所必需的信号。据此制备出HCVAg-trx融合蛋白，若再以TRX作为桥蛋白，制备桥蛋白的单克隆抗体，用辣根过氧化物酶(HRP)标记。则由于桥蛋白及单抗的存在，标记的酶将不再阻碍抗原抗体的结合，能够较好地解决位阻的问题。目的本课题针对现有丙型肝炎诊断试剂的缺陷，通过表达、纯化TRX(桥蛋白)；制备TRX(桥蛋白)单克隆抗体，进行生物学鉴定。用辣根过氧化物酶(HRP)标记，为研制丙肝双抗原夹心ELISA试剂奠定基础。方法1．TRX的表达、纯化将含有TRX基因的大肠杆菌经IPTG诱导表达4小时，收集菌体，冰浴下超声破菌，用亲和层析法纯化目的蛋白，12％SDS-PAGE鉴定。2．杂交瘤细胞株的研制以纯化TRX为抗原免疫8周龄的雌性BALB／c小鼠，三次免疫后，取免疫鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞以6:1的比例融合。在HAT选择培养基中选择培养，用间接ELISA法筛选阳性细胞，有限稀释法克隆和亚克隆，筛选出单克隆细胞株。3．单克隆抗体的制备腹腔接种杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水，并用正辛酸法以及离子层析纯化，10％SDS-PAGE鉴定。4．杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定用秋水仙素阻抑法使细胞阻滞于分裂中期，显微镜下观察，染色体计数，对杂交瘤细胞株进行染色体分析；采用间接ELISA测定单抗腹水效价、单抗相对亲和力；采用间接ELISA和双向免疫扩散法鉴定免疫球蛋白类型及亚类；以改良过碘酸钠法制备酶标抗体并作偶联物免疫活性的测定；以阻断抑制法作TRX单抗识别抗原表位的测定。5．TRX单抗与丙肝融合抗原(HCVAg-trx)反应测定以间接ELISA法和Western blotting鉴定单克隆抗体与丙肝融合抗原(HCVAg-trx)的特异性反应。结果1．TRX的表达、纯化结果12％SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到了高表达，分离效果较好，纯度达到95％。2．杂交瘤细胞株的研制获得2株能稳定分泌抗TRX单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2E8、5D6。3．单克隆抗体的制备经紫外分光光度计测定计算，2E8、5D6单抗的浓度分别为1.55mg／mL、0.839 mg／mL。10％SDS-PAGE结果显示：纯化单抗样品在分子量约为150KD的位置出现有明显的电泳条带，为目的条带，纯度达到80％。4．杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定(1)2E8、5D6的染色体平均条数分别为98、102，符合杂交瘤细胞染色体数约等于小鼠脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞染色体条数之和的理论值，由此证明所制备的细胞为杂交瘤细胞。(2)两株单抗腹水的效价均为1:10~7；相对亲和力分析表明：5D6的相对亲和力高于2E8。(3)两株单抗均为IgG类，IgG1亚类。(4)2E8酶标抗体的免疫活性达到1:100×2~5，5D6酶标抗体达1:100×2~6。(5)2E8和5D6两株单抗相互阻断，证明两者识别的抗原表位显著相关。5．TRX单抗与重组丙肝抗原(HCVAg-trx)反应两株单抗均能与TRX及HCVAg-trx发生特异性结合，而不与无关蛋白IFN-γ产生交叉反应。结论1．采用IPTG诱导表达，亲和层析法纯化，获得高纯度的重组TRX。2．成功运用杂交瘤技术获得两株能稳定分泌抗TRX的杂交瘤细胞株。3．成功对杂交瘤细胞株和纯化后的抗体进行了鉴定。4．两株单抗均能够与丙肝融合抗原发生特异性结合反应。