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课题组前期以裸鼠高致瘤HL-60细胞模型为研究对象,应用差异凝胶电泳和质谱技术鉴定出TCP1为裸鼠致瘤率提高的差异蛋白之一,完成了高致瘤HL-60细胞TCP1 RNAi、TCP1 miRNA靶标筛选的研究工作。目的:本课题以裸鼠高致瘤HL-60细胞和白血病细胞NB4为研究对象,观察miR-340靶向调控TCP1对白血病细胞生物学行为的影响,在miRNA水平探讨裸鼠致瘤率提高及白血病发生发展的分子机制。同时利CRISPR Cas9技术敲除TCP1,观察基因敲除后对白血病细胞生物学功能的影响。方法:1.为明确miR-340在白血病中的表达情况,利用q-PCR技术检测了白血病细胞株miR-340表达水平,明确miR-340与TCP1在白血病之间的关系,我们应用Western blot技术检测不同白血病细胞株中TCP1表达,筛选出TCP1高表达miR-340低表达的细胞株,用于miRNA功能研究。2.应用逆转录病毒载体系统,构建含有pre-miR-340序列的慢病毒表达载体,制备含有pre-miR-340序列的重组慢病毒和不含pre-miR-340的阴性重组慢病毒,利用慢病毒颗粒感染高致瘤HL-60细胞、NB4细胞,建立稳定过表达miR-340的细胞株。3.应用qPCR检测高致瘤HL-60细胞、NB4细胞稳定过表达miR-340后miR-340、TCP1 mRNA表达情况,应用Western blot检测TCP1蛋白水平表达,观察miR-340与TCP1表达之间的相互关系。4.观察白血病细胞过表达miR-340后细胞生物学行为变化:cck-8法检测细胞增殖能力,Western blot检测细胞增殖、凋亡相关蛋白表达水平。5.根据TCP1基因组DNA序列设计sg RNA primer,构建基因敲除载体p GL3-U6-TCP1.1-sg RNA-EF1a-Cas9ZF-IRES-Puromycin和p GL3-U6-TCP1.2-sg RNA-EF1a-Cas9ZF-IRES-Puromycin。将构建好的载体转染至HEK-293T细胞中,检测TCP1敲除效果。结果:1.在白血病细胞株HL-60、HL-60-G4、NB4、U937、KG1筛选出TCP1高表达且miR-340低表达细胞株为HL-60-G4、NB4、KG1细胞。拟选择与HL-60来源类似的NB4细胞进行功能实验,HL-60-G4和NB4细胞miR-340表达量分别为HL-60细胞的26倍和19倍,差异有统计学意义(p<0.05)。2.经测序鉴定,慢病毒重组质粒PLVX-EGFP-3FLAG-Puro中插入pre-miR-340片段,测序结果与预期相符,没有碱基突变或缺失。成功制备了能在靶细胞表达外源性miR-340的慢病毒。3.重组慢病毒以MOI=100感染NB4细胞,以MOI=300感染高致瘤HL-60细胞,72h后荧光显微镜观察感染率大于90%。应适当浓度的嘌呤霉素连续传代培养,建立了稳定过表达miR-340的HL-60-G4细胞株和NB4细胞株。4.实时荧光定量PCR(q-PCR)检测稳定过表达miR-340的高致瘤HL-60细胞、NB4细胞中miR-340表达水平,结果显示,miR-340组分别是NC组的36.4倍和6.7倍,差异有显著意义(p<0.05)。q-PCR检测靶细胞过表达miR-340后TCP1m RNA水平结果显示,与阴性对照组相比,高致瘤HL-60细胞miR-340组TCP1下降到65%。5.为进一步验证TCP1是否为miR-340的靶基因,我们应用Western blot检测了稳定过表达外源性miR-340的HL-60-G4细胞和NB4细胞TCP1表达水平,结果显示与阴性对照组相比,过表达组TCP1下调显著(p<0.01)。6.NB4细胞过表达miR-340后,细胞增殖受抑制。CCK-8检测NB4细胞增殖能力,结果显示24h-72h过表达组细胞增殖抑制率为61.3%-68.5%。7.Western Blot检测结果显示:过表达miR-340后高致瘤HL-60细胞Bcl-2、procaspase-3、Cdk2、Cdk6、蛋白下调,bid蛋白上调,procaspase-8蛋白影响不大;NB4细胞procaspase-9、Bcl-2、cyclin E蛋白下调。同时发现高致瘤HL-60细胞AKT蛋白下调。8.转染TCP1敲除的Cas9载体后HEK-293T细胞大量死亡,瞬转看到TCP1蛋白下调,目前正在筛选TCP1敲除的单克隆细胞株。结论:1.miR-340与TCP1表达呈明显负相关,提示miR-340能有效负调控TCP1的表达。2.外源性过表达miR-340可抑制NB4细胞增殖,有可能是通过下调细胞周期蛋白Cyclin E,下调凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-9介导的。3.miR-340可引起高致瘤HL-60细胞、NB4细胞生物学行为改变,有可能是通过抑制TCP1表达实现的,miR-340的肿瘤抑制效应为白血病研究和抗肿瘤治疗提供了新方向。