食管癌是临床常见且严重危害人类生命和健康的恶性肿瘤之一。据全球癌症统计,2018年新发食管癌有57.2万例,死于食管癌有50.9万例,分别排在所有恶性肿瘤的第七位和第六位。中国食管癌的发病数和死亡数占全球的一半以上。根据组织学类型,食管癌主要包括食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌两种病理类型,我国90%以上的食管癌为食管鳞状细胞癌。目前,食管鳞癌的发病机制尚不完全清楚。因食管鳞癌起病隐匿,大多数患者确诊时已处于进展期,即使通过外科手术、放疗、化疗等综合治疗,其5年生存率仅有15%~25%。因此,研究食管鳞癌发生发展的分子机制,寻找其特异性的分子标志物和治疗靶点,对于提高食管鳞癌诊治水平和改善预后有着重要意义。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200nt,不具有蛋白编码功能的RNA分子。lncRNA通过碱基互补和二级结构形成的茎环与DNA、RNA和蛋白相互作用,能在表观遗传、转录水平、转录后水平等多个层面影响基因表达,参与染色质修饰、转录激活与抑制、核内运输等多种重要的调控过程。研究表明,一方面,lncRNA在正常生理活动过程中扮演重要角色,另一方面,lncRNA的失调涉及多种人类疾病的发生和发展,特别是在肿瘤中。近年来,通过高通量芯片及RNA测序等技术,发现了许多在食管鳞癌中异常表达的lncRNA,已有多个lncRNA分子被证明在食管鳞癌发生发展过程中扮演着促癌或抑癌的角色。另外,部分lncRNA具有良好的功能特征,可作为食管鳞癌诊断、治疗以及预后评估的生物标志物。虽然目前我们对于lncRNA的认识有明显的进步,但是lncRNA数量庞大、种类繁多、结构复杂、机制多样,在肿瘤中的差异表达具有组织和细胞特异性。因此,寻找在食管鳞癌中特异性表达的lncRNA分子,探索其分子机制,对于改善食管鳞癌预后有着重要意义。我们前期选取了5对食管鳞癌组织及其癌旁组织进行lncRNA表达谱芯片检测,结果显示LINC01980(Long intergenic non-protein coding RNA 1980)在食管鳞癌组织中表达水平比相应癌旁组织高200多倍。我们通过NCBI GEO数据库进行检索,结果显示在其它肿瘤中未发现LINC01980的异常表达,提示LINC01980可能是在食管鳞癌组织中特异表达的lncRNA。目前尚未有关于LINC01980的研究报道,因此LINC01980与食管鳞癌患者临床特征的关系如何,在食管鳞癌发生发展中具有什么样的生物学功能,作用机制怎样,值得我们深入研究。本课题的主要研究内容和结果如下:1、LINC01980在食管鳞癌组织中高表达,并与食管鳞癌的转移和预后相关。为了验证芯片结果的准确性,我们利用反转录定量PCR(RT-qPCR)技术检测74对食管鳞癌组织及其癌旁组织中LINC01980的表达,结果显示LINC01980在91.9%(68/74)的食管鳞癌组织中的表达显著高于癌旁组织(p<0.01)。进一步分析发现LINC01980的表达与食管鳞癌的原发肿瘤的浸润深度、淋巴结转移以及TNM分期呈正相关。生存分析显示LINC01980高表达组的食管鳞癌患者预后更差。以上结果表明,LINC01980在食管鳞癌中可能发挥致癌作用,与食管鳞癌的生长、转移和预后相关,可以作为判断食管鳞癌预后的潜在的分子标记物。2、体外和体内功能实验证明LINC01980能促进食管鳞癌细胞的生长和增殖。我们通过RT-qPCR技术检测LINC01980在食管鳞癌细胞和正常食管上皮细胞中的表达情况,结果显示,LINC01980在食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450中的表达显著高于正常食管上皮细胞Het-1A和食管鳞癌细胞EC109,提示LINC01980的表达具有一定细胞特异性。我们利用siRNA干扰食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450中LINC01980的表达,并采用CCK-8和Edu实验,检测LINC01980对细胞生长和增殖的影响。构建慢病毒稳转细胞Del-LINC01980/KYSE450,通过荷瘤小鼠实验检测LINC01980对皮下成瘤能力影响。体外和体内实验证实,干扰LINC01980的表达能显著抑制食管鳞癌细胞的生长、增殖以及裸鼠皮下肿瘤的形成,提示LINC01980能促进食管鳞癌细胞的生长和增殖。我们利用流式细胞技术检测干扰LINC01980表达后食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450的细胞周期和细胞凋亡的变化。结果显示,干扰LINC01980的表达能显著降低食管鳞癌细胞S期和G2/M期细胞比例,增加细胞凋亡。本部分研究结果表明:LINC01980可以通过调控细胞周期和细胞凋亡促进食管鳞癌细胞的生长和增殖。3、体外功能实验证明LINC01980能促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移。我们利用siRNA干扰和质粒过表达食管鳞癌细胞中LINC01980的表达,通过Transwell小室实验和划痕实验检测LINC01980对食管鳞癌细胞侵袭、迁移和运动能力的影响。Transwell小室实验证明,在KYSE150和KYSE450细胞中干扰LINC01980的表达可以显著抑制食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力,在EC109细胞中过表达LINC01980则会增加食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力。划痕实验表明干扰LINC01980的表达能显著抑制食管鳞癌细胞的运动能力。以上结果表明LINC01980能促进食管鳞癌细胞的侵袭、迁移和运动能力。4、LINC01980分别通过上调GADD45A和ETV5的表达促进食管鳞癌细胞的生长和迁移。lncRNA的作用方式与其细胞亚定位密切相关。为了明确LINC01980促进食管鳞癌细胞生长和迁移的作用机制,我们首先通过核质分离实验和RNA FISH技术检测LINC01980在细胞内分布情况,结果表明LINC01980在KYSE150和KYSE450的细胞核以及细胞质中表达均较丰富,提示其功能的多样性及调控机制的复杂性。然后,我们在KYSE450细胞中干扰LINC01980的表达,通过mRNA芯片分析研究干扰LINC01980表达后mRNA表达谱变化,把表达下调的mRNA进行信号通路富集分析和功能富集分析,发现LINC01980参与了许多生物学过程和疾病,如MAPK信号通路、FOXO信号通路和转录失调等,其中,包括许多已知的与增殖和转移相关基因(例如,TGFB2、CDC25B、GADD45A、EP300、ETV5、BMP2K、CCNT1和ELK4等)。进一步通过RT-qPCR和Western Blot实验发现,生长抑制和DNA损伤诱导α蛋白(Growth arrest and DNA damage inducible alpha protein,GADD45A)和ETS转录因子5(ETS variant 5,ETV5)的表达下调较明显,提示GADD45A和ETV5可能受LINC01980调控。RT-qPCR结果显示GADD45A在50%(11/22)的食管鳞癌组织中的表达高于相应癌旁组织,ETV5在72.7%(16/22)的食管鳞癌组织中的表达高于相应癌旁组织。CCK-8实验显示,干扰GADD45A表达后,KYSE150和KYSE450细胞的生长能力减弱。Transwell小室实验显示,干扰ETV5表达后,KYSE150和KYSE450细胞的迁移能力减弱。回复实验结果表明,过表达GADD45A可以减弱干扰LINC01980表达导致的食管鳞癌细胞生长能力的下降,过表达ETV5可以减弱干扰LINC01980表达导致的食管鳞癌细胞迁移能力的下降,说明GADD45A和ETV5是LINC01980发挥作用的靶基因。本部分研究结果表明:LINC01980在食管鳞癌细胞的细胞核和细胞质中均有分布,LINC01980分别通过调控GADD45A和ETV5的表达促进食管鳞癌细胞的生长和迁移。综上所述,本课题发现LINC01980在食管鳞癌组织中表达明显上调,高表达LINC01980与食管鳞癌患者的不良预后相关。体内外功能实验证实LINC01980具有促进食管鳞癌细胞的生长、增殖、侵袭和迁移能力。机制研究表明LINC01980分别通过调控GADD45A和ETV5的表达促进食管鳞癌细胞的生长和迁移。本研究发现LINC01980在食管鳞癌中异常高表达,并阐明了LINC01980在食管鳞癌中的生物学功能,初步探讨了LINC01980调控的下游靶分子,为理解lncRNA在食管鳞癌中的生物功能和作用机制提供了新的证据,也为食管鳞癌的早期诊断和预后提供了一个潜在的分子标志物。