论文部分内容阅读
目的：探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)对同种异体外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMCs)及CD8+T淋巴细胞增殖、功能的抑制作用,并进一步探索其抑制CD8+T淋巴细胞的作用机制，为MSCs应用于临床的自身免疫性疾病，移植物抗宿主反应等所致免疫性疾病提供实验依据。材料和方法：采用密度梯度离心法和贴壁法进行分离培养MSCs，通过Ficoll-Pague密度梯度离心法分离PBMCs，从形态学、表面标记物的表达情况及多向分化能力等方面对MSCs进行鉴定；MSCs与PBMCs不同比例共培养，应用CCK-8法检测MSCs对植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激PBMCs增殖的抑制作用；并应用流式细胞仪技术检测MSCs对PHA诱导CD8+T淋巴细胞增殖的抑制作用；最后应用Transwell法阻断MSCs与CD8+T淋巴细胞亚群之间的细胞接触，探索细胞接触在MSCs抑制CD8+T淋巴细胞增殖作用中的角色；用免疫磁珠分选出CD8+T淋巴细胞，并用流式细胞仪检测其纯度；然后将MSCs与CD8+T淋巴细胞共培养，72小时后收集其中的CD8+T淋巴细胞，提取RNA，应用荧光定量PCR法，检测各组CD8+T淋巴细胞内的白细胞介素-2（interleukin-2, IL-2）、颗粒酶B（Granzyme B,Gzmb）、γ-干扰素（Interferon‐γ, IFN-γ）等细胞因子的mRNA表达的情况。结果：1：体外成功分离培养获得MSCs及PBMCs；2：MSCs与PBMCs共培养条件下，当MSCs与PBMCs比例为1:5、1:1时，与未添加MSCs的实验组相比，MSCs可抑制PHA刺激的PBMCs及其中的CD8+T淋巴细胞亚群的增殖，统计学具有差异性（P＜0.05）；MSCs与PBMCs比例为1:10、1:20和1:50时，与未添加MSCs的实验组相比，MSCs抑制PBMCs及其中的CD8+T淋巴细胞亚群的增殖，统计学不具有差异性（P＞0.05）；3：当MSCs与PBMCs按照1:1及1:5的比例混合培养时，采用Transwell法阻断MSCs与CD8+T淋巴细胞亚群之间的细胞接触的实验组与不阻断细胞接触的非Transwell实验组相比，MSCs抑制PHA引起的CD8+T淋巴细胞亚群增殖作用无明显差异性（P＞0.05）；4：通过免疫磁珠法，成功分离纯化CD8+T淋巴细胞；5：通过PCR法检测CD8+T淋巴细胞内的IL-2、Gzmb和IFN-γ等细胞因子的mRNA表达水平：在未经PHA处理的CD8+T淋巴细胞中，三者的mRNA水平均有表达，但是表达水平较低，加入PHA刺激后，其mRNA表达水平明显升高；当加入一定比例浓度的MSCs（MSCs：CD8+T=1:5）后，其CD8+T淋巴细胞中三者的mRNA表达水平与未添加MSCs的实验组相比明显下降，统计学有明显差异性（P＜0.05）。结论：MSCs可抑制PHA刺激的同种异体PBMCs及CD8+T淋巴细胞的增殖，其作用机制可能与细胞直接接触和分泌效应因子有关。