烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种环境中常见的、以空气传播方式感染的机会性致病菌。临床上主要感染免疫力低下患者的肺部,并可能侵袭体内其他器官组织。近年来,随着国内人口老龄化数量不断加大以及各种抗真菌的药物滥用,导致免疫力低下的人群数量急剧增加,从而使临床因烟曲霉深部感染患者数量已经占据深部真菌感染数量的第二位。对人类生命健康的威胁正逐步加剧。本研究利用前期实验室成熟的烟曲霉ATMT转化体系,成功运用ATMT技术转化烟曲霉,并获得烟曲霉突变株1513株。将1513株突变体进行形态筛选,包括菌丝、产孢量、色素以及白化等因素的变化,找出变化明显的突变体,通过进一步的形态以及分子生物学验证,寻找其突变位点以及突变位点相关的基因与形态变化之间的关系,从而为研究烟曲霉生长发育或致病性相关机制奠定了基础。烟曲霉属于耐高温菌株,实验将1513株烟曲霉突变体在25度(环境温度)、37度(人体温度)和48度(高温)培养箱中进行培养,并对表型进行筛选,获得含AFM70808菌株在内的共计8株菌落形态变化较大的突变体,并对这8株菌株的突变位点进行成功的定位,对其突变位点具体分析发现,其中有5株菌株突变位点在一个基因上,有3株菌株的突变位点在两个及以上基因之间。对8株突变菌株进行线虫致病性实验,验证菌株的致病性变化,发现菌株AFM6284在表型变化的基础之上其致病性最低。结合大量文献的查阅,菌株AFM6284突变体的突变基因研究意义最大,选择其为后期主要研究的对象。对AFM6284敲除突变位点基因分析,发现该基因为Phosducin family protein(光传导家族蛋白,Pho),对于Pho蛋白在真菌中的功能研究相对较少,已知其同源物在模式动物中主要与G蛋白βγ亚基结合而参与调解视杆细胞的信号调解或以伴侣分子的方式与βγ亚基结合参与G蛋白偶联-cAMP-PKA通路的调节。而其他功能报道相对较少。本研究通过应用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除,通过构建Pho基因的CRISPR/Cas9敲除质粒,并成功敲除Pho基因。ΔPho敲除株的表型变化在三种不同温度下与AFM6284表现一致,线虫模型验证其致病性也一致。为进一步确定该基因所在基因通路,通过光照实验以及检测cAMP浓度发现,该基因在光传导基因通路中发挥功能不大,而Pho基因的缺失使cAMP浓度明显降低,从而发现Pho基因主要参与G蛋白偶联-cAMP-PKA通路。综上所述,AFM6284菌株与ΔPho敲除株由于Pho基因缺失,从而导致其生长缓慢,并且其致病性降低。进一步验证发现,Pho基因编码的Pho蛋白在烟曲霉中主要参与G蛋白偶联-cAMP-PKA通路,且Pho蛋白的缺失抑制cAMP的产生,以正向调节的方式调节cAMP的浓度,从而调节cAMP下游通路。本研究为进一步探究Pho基因在基因通路中的作用以及进一步阐明其致病机制奠定基础,为临床治疗病原性真菌感染提供理论支持。