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研究背景和目的肺癌的肿瘤相关死亡率在恶性肿瘤中居首位,其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌类型的80-85%。随着分子诊断技术的深入研究,有驱动基因的晚期NSCLC患者的治疗模式转向基于驱动基因分型的靶向治疗。棘皮动物微管蛋白4-间变淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因是肺癌驱动基因的一种,约占NSCLC 3%-5%。PROFILE1014研究显示,第一代间变性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制剂(ALKTKI)Crizotinib用于治疗晚期ALK阳性NSCLC患者的客观有效率高达74%,奠定了Crizotinib作为晚期ALK阳性NSCLC患者一线治疗的地位,但大多数患者在接受治疗约11个月后病情出现进展。ALK激酶域二次突变是Crizotinib的主要耐药机制之一,第二代及第三代ALK-TKIs可以克服大部分Crizotinib耐药引起的二次突变。尤其是第三代ALK-TKI Lorlatinib,一种新型、高选择性、高效的TKI,对包括G1202R在内的所有Crizotinib耐药突变具有较好的抗肿瘤活性。既往研究显示,虽然Lorlatinib用于既往接受过一种ALK-TKI治疗的晚期ALK阳性NSCLC患者时,其客观有效率为57%,但患者在治疗约14个月后也会不可避免地出现获得性耐药。针对晚期ALK阳性NSCLC患者的治疗,目前临床上存在两个主要问题。第一,第三代ALK-TKI Lorlatinib的确切耐药机制尚未阐明,其耐药后缺乏相应的靶向治疗。第二,化疗仍是Lorlatinib耐药后的主要选择之一,但目前暂缺乏ALK阳性NSCLC患者Lorlatinib耐药后对不同化疗药物的敏感性差异的研究。所以探讨Lorlatinib的耐药机制、选择合适的化疗药物是临床面临的重要问题。基于以上研究背景,本研究选用EML4-ALK融合基因阳性、对Crizotinib耐药的NSCLC细胞株SNU-2535,以逐步递增Lorlatinib剂量的方法建立获得性耐药细胞株SNU-2535 LR,在此基础上进一步探讨其耐药机制、克服其耐药的治疗策略以及耐药细胞对不同化疗药物敏感性的差异。以期为临床Lorlatinib耐药的晚期ALK阳性NSCLC患者的后续治疗方案的选择提供理论指导,具有重要的临床意义。方法1、非小细胞肺癌Lorlatinib获得性耐药细胞株的建立:体外逐步递增Lorlatinib剂量法诱导处理SNU-2535细胞,建立Lorlatinib获得性耐药细胞株SNU-2535 LR;二代测序(NGS)技术检测SNU-2535细胞基因突变情况;CCK-8法验证SNU-2535细胞Crizotinib耐药性、SNU-2535 LR细胞Lorlatinib耐药性以及绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测耐药前后细胞周期分布变化;倒置显微镜观察耐药前后细胞形态学变化;Western blot法检测耐药前后细胞上皮间质转化(EMT)标志蛋白表达变化。2、Lorlatinib耐药细胞株SNU-2535 LR耐药机制及耐药后对不同化疗药物敏感性差异的探讨:NGS技术检测SNU-2535 LR细胞基因突变情况;CK-8法检测耐药细胞对Crizotinib敏感性、不同化疗药物敏感性及APR-246的耐药逆转作用;Western blot法检测EML4-ALK融合基因相关蛋白表达变化。3、统计学方法:以上所有试验重复3次,应用Graphpad Prism 7.0软件作图,SPSS 20.0统计学软件统计数据,数值以均数±标准差(mean±SD)表示,t检验用于两组之间的比较,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果1、非小细胞肺癌Lorlatinib获得性耐药细胞株的建立1)NGS检测结果显示,SNU-2535细胞EML4-ALK融合基因阳性,合并Crizotinib耐药突变ALK p.G1269A;CCK-8法结果显示,SNU-2535细胞对Crizotinib的敏感性明显弱于Crizotinib敏感细胞NCI-H3122,P<0.05,IC50值分别为(1.211±0.033)和(0.187±0.007)μmol/L,RI为6.476。证实SNU-2535为Crizotinib耐药细胞。2)历时7个月在体外构建了Lorlatinib获得性耐药细胞株SNU-2535 LR,CCK-8法结果显示,对比SNU-2535细胞,SNU-2535LR对Lorlatinib敏感性明显下降,P<0.05,IC50值分别为(1.362±0.324)和(46.433±9.562)μmol/L(P<0.05),RI约为34.148,表明成功建立Lorlatinib获得性耐药细胞。3)与亲本细胞SNU-2535的形态相比,耐药细胞SNU-2535 LR体积明显变小、触角明显增多,且生长相对松散。4)Western blot实验结果显示上皮型蛋白E-cadherin蛋白表达减少(p<0.05);间质型标志蛋白Vimentin蛋白表达明显下降(p<0.05),N-cadhrein蛋白表达未见明显差异(P>0.05)。表明耐药细胞没有发生EMT表型变化。5)通过细胞生长曲线计算得SNU-2535细胞的倍增时间约为3.425d,SNU-2535 LR细胞的倍增时间约为1.963d;细胞周期分布结果显示,对比亲本细胞,SNU-2535 LR细胞G1期细胞比例减少(P<0.05),G2+S期比例增加(P<0.05)。表明耐药细胞具有更强的增殖能力。2、Lorlatinib耐药细胞株SNU-2535 LR耐药机制及耐药后对不同化疗药物敏感性差异的探讨1)NGS检测结果显示,与亲本细胞SNU-2535相比,SNU-2535LR细胞EML4-ALK融合基因丰度显著下降、ALK p.G1269A突变缺失;耐药细胞最主要的其他突变基因是TP53突变,丰度接近100%;在ALK激酶域没有发现其他基因突变及融合基因扩增。2)Western blot法结果提示,SNU-2535 LR细胞EML4-ALK融合基因相关蛋白表达明显下降,p<0.05。3)CCK-8法结果显示,与亲本细胞相比,耐药细胞SNU-2535 LR对Crizotinib的敏感性明显下降,p<0.05,IC50值分别为(1.211±0.033)和(4.726±1.056)μmol/L。表明SNU-2535 LR细胞Crizotinib耐药突变G1269A缺失后,未能恢复对Crizotinib的敏感性。4)CCK-8法结果显示,联合p53蛋白激动剂APR-246能部分逆转Lorlatinib的耐药,逆转倍数为4.768。表明合并TP53突变可能是SNU-2535 LR细胞的耐药机制之一。5)SNU-2535 LR细胞对吉西他滨、多西他赛和紫杉醇敏感性均优于顺铂和培美曲塞(P<0.05)。且其对吉西他滨、多西他赛和紫杉醇的敏感性明显高于亲本细胞(P<0.05)。结论首次在Crizotinib耐药基础上成功建立NSCLC Lorlatinib获得性耐药细胞SNU-2535 LR。Lorlatinib联合p53蛋白激动剂能部分逆转其耐药,合并TP53突变可能是其耐药机制之一。我们所构建的Lorlatinib获得性耐药细胞株对吉西他滨、多西他赛、紫杉醇的敏感性优于顺铂和培美曲塞。