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昆虫生长调节剂(IGR)因对害虫具有高度的选择性、对哺乳动物安全、对环境友好等特点逐渐在生产实践中取代传统的高毒高残留农药如:有机磷、氨基甲酸酯等成为害虫防治的主要手段。定虫隆(Chlorfluazuron)等苯甲酰基脲类(BPUs)几丁质合成抑制剂显著抑制昆虫表皮几丁质的形成,使各龄期幼虫的蜕皮变态受阻,而发挥高效的昆虫生长调节作用。目前,BPUs在昆虫体内的具体作用靶标仍不清楚。本研究拟从细胞生理角度探讨BPUs对粉纹夜蛾Tn5B1-4细胞、草地贪夜蛾Sf-21细胞以及人胚肾HEK293细胞、人肝癌Hep G2细胞的作用选择性机制,获得BPUs发挥高效调节作用的细胞学依据。
台盼兰拒染实验表明,定虫隆对Tn5B1-4、Sf-21、HEK293和Hep G2细胞的存活率没有显著影响,表明其对细胞无杀伤作用。MTT分析法表明,定虫隆对Tn5B1-4和Sf-21细胞的活力具有明显的抑制作用,并具时间-剂量效应,其对二者的相对抑制率最高分别为80.82%和69.06%。恢复实验表明,10μM定虫隆48h的活力抑制作用具有持效性,持效时间24h,而96h处理的抑制效果皆可逆。定虫隆对HEK293和Hep G2细胞的活力抑制作用较低,最大抑制率约40%,且抑制作用皆可逆。贴壁抑制实验表明,定虫隆不影响Tn5B1-4、Sf-21细胞以及HEK293、Hep G2细胞的粘附作用。细胞形态毒理学实验表明,Tn5B1-4细胞的铺展作用受到定虫隆的显著抑制。单细胞集落形成实验表明,Tn5B1-4对定虫隆最为敏感,1.25μM定虫隆处理下其形成率不到15%,而20μM时小于0.1%;Sf-21其次,1.25μM时为80.3%,20μM时为2.15%。但HEK293和HepG2细胞则相对不敏感。
通过对细胞几丁质含量和可溶性总蛋白含量的考察,发现Tn5B1-4和Sf-21细胞的“几丁质/蛋白质”比值随定虫隆浓度的增大而逐步减小。而HEK293和Hep G2细胞的几丁质含量对测试无响应,其总蛋白含量无显著变化。对于定虫隆对Tn5B1-4和Sf-21所表现出的明显的选择性,考察了外源离子对定虫隆作用的影响,结果表明Mg2+、Ca2+、Na+以及K+对定虫隆均无协同作用。流式细胞周期实验表明,10μM定虫隆作用48h可诱导Tn5B1-4细胞产生20%左右的G2/M期阻滞效应,诱导Sf-21细胞产生10%左右的G2/M期阻滞效应,而对HEK293河Hep G2细胞周期无任何显著影响。吉姆萨染色实验进一步表明,定虫隆对Tn5B1-4和Sf-21细胞所诱导的G2/M期阻滞作用主要为抑制细胞周期G2-M时相的转变。