高渗盐水(Hypertonic saline, HS)常在临床上用于治疗各种原因导致的脑水肿,与甘露醇相比,其疗效更持久、降颅压幅度更大,但尿量却更少。有研究发现其减轻脑水肿的机制并不仅仅是通过传统上认为的渗透性脱水机制,还有非渗透性机制在参与,它可以通过减少脑缺血灶周边组织水通道蛋白AQP4的表达减少对水的转运,和/或抑制脑微血管周边星形胶质细胞上血管内皮生长因子VEGF及其受体VEGFR2的表达,减小血脑屏障对水的通透性从而减轻脑水肿。另一个与脑水肿密切相关的蛋白,钠、钾、氯同向转运蛋白1(Na+-K+-Cl-cotransporterl, NKCC1)受到广泛关注,研究表明利用其特异性抑制剂可以明显减轻脑水肿,并且可改善脑神经功能预后。前期动物实验证实HS可以通过减少脑缺血灶周边NKCC1的表达而减轻脑水肿,还可以抑制脑内小胶质细胞释放炎症因子,但其机制尚不明确。本实验通过体外培养小胶质细胞及星形胶质细胞,探讨HS对小胶质细胞上炎症因子表达及释放的影响、炎症因子对星形胶质细胞上NKCC1的影响,以及HS是否与星形胶质细胞上NKCC1R表达存在直接的关系,以阐明HS与减少炎症因子释放及下调NKCC1表达的潜在机制。第一章高渗盐水对原代小胶质细胞释放炎症因子的影响目的：从混合培养的胶质细胞中纯化分离得到小胶质细胞,在缺氧状态下利用HS进行干预,探讨HS是否会影响小胶质细胞释放炎症子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)及单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)。方法：取出生0-24h的SD大鼠乳鼠的大脑皮层,胰酶消化后进行混合胶质细胞培养,培养7-10天后利用摇床震摇法纯化分离得到小胶质细胞,利用免疫荧光的方法检测小胶质细胞纯度,如果纯度大于95%则可进行下一步实验。首先检测不同浓度的HS对小胶质细胞活性的影响,将纯化后的细胞分为三组：对照组、缺氧+无糖培养基(缩写为：缺氧组)及缺氧+无糖培养基+HS(缩写为：HS组),其中HS组又根据HS的浓度分为7个亚组：40mM、60nM、80mM、100mM、120mM、140mM及160mM组,缺氧组及HS各组在3%02,5%C02,92%N2条件下进行缺氧。各组进行相应处理4小时后利用CCK-8的方法检测各组细胞活性。为确定最佳的缺氧时间,将纯化的小胶质细胞分为对照组及缺氧组,缺氧组又根据不同的缺氧时间分为1h组、2h组及4h组。各组处理至相应时间后提取细胞培养基上清,利用ELISA的方法检测培养基中TNF-α含量。为筛选最佳HS浓度,将小胶质细胞分为对照组、缺氧组、HS组(浓度由前面细胞活性结果决定),缺氧时间由前面最佳缺氧时间决定。各组在相应处理后提取细胞培养基上清进行ELISA实验,检测其中炎症因子TNF-a的含量。在确定最佳缺氧时间及最佳HS浓度后,探索HS是否可以抑制小胶质细胞释放炎症因子,小胶质细胞被分为3组：对照组、缺氧组及HS组,缺氧组及HS组于3%O2,5%CO2,92%N2的条件下缺氧,在进行相应处理后利用ELISA的方法检测小胶质细胞培养基中炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的含量。结果：混合培养小胶质细胞在培养两天后大多数细胞均可良好贴壁,可较清楚分辨出形态,多呈多边形或棒状；培养至第五天时,混合胶质细胞已铺满瓶底70%,培养基上清中可见少量圆形、折光性强的细胞；第七天胶质细胞已铺满瓶底,折光性强的细胞逐渐增多；第九天时,细胞上清中折光强的细胞大量增多。利用摇床震摇法纯化的小胶质细胞,免疫荧光方法检测纯化后的小胶质细胞的纯度为97.16±0.983%。细胞活性检测发现HS120mM、140mM、160mM组的小胶质细胞活性明显下降(P<0.05),而40mM、60mM、80mM、100mM组的小胶质细胞与对照组相比活性无明显差异(P>0.05)；小胶质细胞在缺氧后1,2,4小时均释放大量的炎症介质,以4小时TNF-a含量最高(P<0.05);40mM HS.60mM HS、80mM HS、100mM HS组在缺氧4小时后,TNF-a含量均明显减少(P<0.05),其中以100mM组减少最为明显。根据上述筛选结果,缺氧组小胶质细胞在缺氧4小时后释放的炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1明显增加(P<0.05)；而使用100mM HS处理的HS组与缺氧组相比,小胶质细胞释放炎症因子明显减少(P<0.05)。结论：小胶质细胞在缺氧后各个时间均迅速激活并释放大量炎症因子,而不同浓度的HS均可一定程度上抑制缺氧后小胶质细胞的激活并减少其释放炎症因子的含量,具有减轻炎症反应的作用。第二章高渗盐水影响小胶质细胞释放炎症因子的机制目的：探讨100mM HS影响小胶质细胞激活及释放炎症介质的潜在机制方法：利用p38及JNK信号通路的特异性抑制剂SB203580及SP600125探讨小胶质细胞是否是通过这两条信号通路释放炎症因子。原代培养混合胶质细胞后进行纯化,将纯化的细胞分为五组：对照组、缺氧组、HS组、缺氧+无糖培养基+SB203580组(缩写为：SB203580组)及缺氧+无糖培养基+SP600125组(缩写为：SP600125组),然后在3%O2,5%CO2,92%N2的条件下缺氧4小时,利用ELISA的方法检测各组培养基中炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的含量。为检测HS是否会影响小胶质细胞中的p38及JNK两条信号通路,将纯化后的细胞分为对照组、缺氧组及HS组,缺氧组和HS组又根据缺氧时间不同分为30min,1h,2h,4h组,缺氧至相应时间点后,提取各组细胞的总蛋白进行western blot实验,检测Phos-p38及Phos-JNK蛋白水平。结果：与对照组相比,小胶质细胞在缺氧4小时后释放大量的炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1(P<0.05),而与缺氧组相比,HS组、SB203580组及SP600125组中炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1含量均明显减少(P<0.05); western blot实验显示缺氧组小胶质细胞在缺氧30分钟后即可观察到Phos-p38及Phos-JNK蛋白表达明显增加并持续到4小时(P<0.05),而HS组小胶质细胞中,缺氧各个时间点表达的Phos-p38及Phos-JNK蛋白与缺氧组相比均明显减少(P<0.05)。结论：HS可能通过抑制小胶质细胞上的p38及JNK这两条信号通路激活而减少了炎症因子的释放,减轻了缺血缺氧后脑内的炎症反应,防止炎症反应的进一步扩大,从而保护了血脑屏障,有利于减轻脑水肿。第三章炎症因子TNF-及IL-1β对星形胶质细胞表达NKCC1的影响目的：探讨炎症因子TNF-α及IL-1β对星形胶质细胞上NKCC1表达的影响,以及TNF-a及IL-1β浓度的变化是否会影响NKCC1的表达。方法：原代培养星形胶质细胞,利用震摇的方法纯化后将星形胶质细胞分为6组,分别是：对照组、TNF-α (10ng/ml)+无糖培养基组(缩写为：TNF-α (10ng/ml)组)、TNF-α(5ng/ml)+无糖培养基组(缩写为：TNF-α (5ng/ml)组)、IL-1β(10ng/ml)+无糖培养基组(缩写为：IL-1β(10ng/ml)组)、IL-1β(5ng/ml)+无糖培养基组(缩写为：IL-1β(5ng/ml)组)、TNF-α(10ng/ml)+TNFR特异拮抗剂(2μM)(TNFR antagonist组)+无糖培养基组、IL-1β(10ng/ml)+IL-1R拮抗剂(2μM)(IL-1R antagonist组)+无糖培养基组及无糖培养基组(缩写为：Glucose-free medium组)。实验前加入相应浓度的细胞因子,处理4小时后进行相应的检测。然后利用免疫荧光双标、western blot及RT-PCR的方法进行检测星形胶质细胞上NKCC1的表达。结果：免疫荧光实验表明TNF-α及IL-1β可明显增加星形胶质细胞上NKCC1表达,而TNF-α及IL-1β相应的受体特异拮抗剂则可以明显下调NKCC1的表达；RT-PCR及Western blot结果显示,5ng/ml或10ng/ml的TNF-α或IL-1β均可以明显上调NKCC1mRNA及蛋白的表达,并且随着炎症因子浓度升高,NKCC1mRNA及蛋白的表达也随之增高(P<0.05),在应用TNF-α及IL-1β相应的受体特异拮抗剂后NKCC1mRNA及蛋白的表达明显降低(P<0.05)；另外,NKCC1的表达不受无糖培养基的影响。结论：炎症因子TNF-α、IL-1β可以明显上调星形胶质细胞上NKCC1的表达,引起脑水肿;并且随着炎症因子TNF-α及IL-1p浓度的增加,星形胶质细胞上NKCC1的表达也随之增加,从而加重脑水肿。而HS可以明显抑制小胶质细胞释放炎症因子TNF-α及IL-1β,从而下调星形胶质细胞上NKCC1的表达,达到减轻脑水肿的效果。第四章HS对星形胶质细胞上NKCC1的直接影响目的：探讨HS是否会直接影响缺氧状态下星形胶质细胞上NKCC1的表达方法：将原代培养的星形胶质细胞分为对照组(完全正常培养)、缺氧组、HS组及缺氧+无糖培养基+100mM Bumetanide(缩写为Bumetanide组),缺氧组、HS组及Bumetanide组均在3%O2,5%CO2,92%N2的环境中缺氧4小时。在缺氧前30分钟,HS组及Bumetanide组分别加入终浓度为100mM的HS和100μM的Bumetanide。各组相应处理4小时后,利用免疫荧光双标、western blot及RT-PCR的方法检测星形胶质细胞上NKCC1的表达。结果：缺氧组、HS组及Bumetanide组星形胶质细胞在缺氧之后,NKCC1mRNA的表达较对照组明显上调；但HS及bumetanide组与缺氧组相比,NKCC1mRNA的表达量明显减少。免疫荧光实验结果显示,与对照组相比,缺氧4小时后缺氧组、HS组及Bumetanide组中星形胶质细胞上NKCC1的表达均明显上升；而HS组及Bumetanide组与缺氧组相比,NKCC1蛋白表达则明显下降(P<0.05)。Western blot结果表明缺氧组、HS组及Bumetanide组在缺氧4小时后,NKCC1蛋白表达均明显上升(P<0.05)；而HS组及Bumetanide组与缺氧组相比,NKCC1蛋白表达量明显下降(P<0.05)。结论：缺氧以后星形胶质细胞上NKCC1的表达明显增加,而HS可以在缺氧条件下直接抑制星形胶质细胞上NKCC1的表达,从而减轻脑水肿,但HS直接抑制NKCC1表达的确切机制仍有待进一步研究。