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肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)作为泌尿生殖系中三大恶性肿瘤之一,每年造成超过140,000患者死亡,严重危害人类的健康。肾脏表达了丰富的药物转运体,在疾病状态下,肾脏转运体常发生异常表达,肾癌化学治疗的耐药与此密切相关。目前,化疗仅作为局限性肾癌的补充治疗手段,有效率只有10%-15%。在肾脏转运体异常表达调控中,表观遗传修饰的异常改变发挥了重要的作用。我们实验室前期的研究表明,肾细胞癌中有机阳离子转运体OCT2基因转录抑制受到DNA甲基化和组蛋白乙酰化机制的双重调控。OCT2启动子区域CpG岛的高甲基化修饰,抑制了转运因子c-Myc在启动子区域的结合,导致c-Myc无法招募下游MLL1蛋白,进而抑制了转录激活信号H3K4Me3,使得OCT2表达降低;除DNA甲基化外,组蛋白乙酰化也参与了 OCT2表达抑制的调控:转录因子c-Myc还可能通过招募肾癌中异常高表达的HDAC7/9使得组蛋白乙酰化水平减弱,抑制了OCT2表达。可见,RCC中OCT2的表达抑制受到多种机制的调控。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性单链小分子RNA,参与调节生物体内绝大多数生理过程。为了探究miRNA是否参与了 RCC中OCT2表达抑制,我们通过生物信息学软件和数据库预测了能够与编码OCT2基因SLC22A23’-UTR结合的miRNA。经过各个数据库的交叉比对,我们筛选获得hsa-miR-630,155,181,431和488作为候选研究对象。随后,我们对RCC肿瘤组织和配对正常组织中目标miRNAs表达差异进行检测,发现在RCC组织中miR-630和miR-155表达较癌旁正常组织异常升高。为了研究miR-630和miR-155是否参与了 RCC中OCT2表达抑制的调控,我们构建了双荧光素酶报告基因模型,研究了目标miRNA在OCT2 3’-UTR的结合情况。结果表明,miR-630能够与OCT2 3’-UTR结合进而抑制OCT2的表达,且将OCT2 3’-UTR上miR-630结合位点突变后,miR-630的结合调控作用消失,而miR-155未见明显的结合调控现象。我们以RCC细胞株786-O和769-P为模型,进一步揭示miR-630异常表达上调对OCT2表达的调控作用。在细胞中高表达miR-630后,我们发现OCT2mRNA水平被显著抑制,且对经典荧光底物ASP+的摄取能力亦减弱;反之,利用miR-630抑制剂浓度梯度抑制miR-630的活性后,OCT2mRNA表达水平得到上调,对于经典底物MPP+的摄取能力增强。但是,其上调水平并不能达到给以DNMT抑制剂地西他滨后OCT2的上调水平,提示miR-630对OCT2的调控可能并未占主导作用。随后,我们建立了 miR-630和OCT2共表达786-O稳转细胞模型(786-O-miR-630/OCT2),进一步考察miR-630高表达后奥沙利铂对于肾癌细胞的毒性。MTT结果表明,奥沙利铂对786-O-miR-630/OCT2细胞的IC50显著高于786-O-OCT2细胞。基于上述研究结果,我们进一步分别构建了 786-O-miR-630/OCT2和786-O-OCT2裸鼠CDX模型,并评价奥沙利铂在体内对瘤体的作用。结果显示,786-O-miR-630/OCT2裸鼠CDX模型组对奥沙利铂的耐受性显著高于786-O-OCT2裸鼠CDX模型,其肿瘤生长速度和肿瘤大小与786-O裸鼠CDX模型组肿瘤生长状况无显著性差异,表明miR-630过表达能够引起786-O对奥沙利铂耐药。为探究miR-630在RCC中表达升高的调控机制,我们进一步考察了原癌基因c-Myc在RCC组织和配对正常组织的表达情况。实验发现RCC组织中c-Myc mRNA水平和蛋白水平均显著上调。通过双荧光素酶报告基因检测发现,c-Myc能够结合miR-630初始转录本编码基因启动子区域,激活其转录,且同时突变c-Myc在其启动子区域的结合位点后激活现象才会消失,提示c-Myc可能通过双位点识别并结合在miR-630初始转录本编码基因启动子进行转录激活调控。我们通过染色质免疫共沉淀技术发现肾癌组织中c-Myc在miR-630初始转录本编码基因启动子区域结合显著高于正常组织,进一步证明c-Myc可能是RCC中miR-630高表达的调控因子。综上所述,我们发现了 RCC中原癌基因的c-Myc能激活miR-630初始转录本转录,提高miR-630的表达,进而抑制了 OCT2基因转录。体内体外实验结果均表明,miR-630的高表达会降低肾细胞癌细胞对于奥沙利铂的敏感性。因此,本实验为临床药物开发提供新靶点,亦为临床联合用药提供新思路。