目前,肝癌的发生机制与细胞起源仍然存在着较大的争议,肿瘤干细胞理论认为癌症是一种干细胞疾病,因此,深入研究肝癌干细胞不仅能够阐明肝癌发生的机制,而且对肝癌的临床诊断、治疗及预后具有重要的意义。目前,肝癌干细胞研究中的首要问题是肝癌干细胞的鉴定方法尚未成熟和标准化,缺乏足够特异、准确的分子标记。新近研究表明CD90在肝脏发生期间的肝干／祖细胞细胞中表达,而成熟肝细胞中不表达CD90,其功能复杂,在细胞的粘附、凋亡,肿瘤的生长,转移等多种细胞活动中均有其参与,也有文献报道利用CD90分离出具有干细胞性的肝癌细胞,本文利用免疫磁珠间接标记法对人肝癌细胞系SMMC-7721进行CD90阳性细胞的分选和初步鉴定研究。目的：分选富集人肝癌细胞系SMMC-7721中的CD90阳性细胞及CD90阴性细胞,做单克隆化培养及传代培养,初步分析比较CD90阳性细胞与阴性细胞的干细胞标志物和相关基因的表达。方法：利用免疫磁珠间接标记法富集SMMC-7721中的CD90阳性细胞,以未分选的7721细胞和CD90阴性细胞为对照,传代培养；同时对CD90阳性细胞及CD90阴性细胞利用细胞有限稀释法进行单克隆培养及扩大培养；流式细胞仪分析每组和每代细胞的CD90、CD133、CD34、CD45等干细胞标志物表达,实时荧光定量PCR检测AFP、CCNA2、CLDN10、PTEN、SPINT、TFDP1等17个肝癌相关基因的表达,免疫细胞化学染色分析AFP、CK18、CK19等蛋白表达。结果：四次磁珠分选实验均较为成功地富集了7721中的CD90+阳性细胞,但所得目的细胞数及纯度较低,分选前CD90在该细胞系中的表达率为0.8%～1.2%,分选后其表达率依次为7.5%、9.0%、30.7%和27.2%,细胞数分别为1.37×104、1.23×104、1.42×104和2.85×104。经过改良PBS配方(PBS+2%FBS+0.5μM EDTA)所得目的细胞纯度及细胞活性有提高至30.7%,但细胞数没有明显增加。镜下观察有限稀释法培养的细胞,大多数克隆培养的细胞均能持续分裂增殖,最初某些克隆间存在着形态差异,但随着其生长传代及扩大培养,传代至P2时细胞即呈现相互混杂的多种形态,克隆之间细胞形态差异趋于模糊。另外,少数克隆培养的细胞生长3-4d后观察到其细胞皱缩并最终死亡；同时,在扩大培养的克隆化细胞时,即使在同一培养孔中也会有部分细胞皱缩、死亡。流式细胞仪检测CD34、CD45、CD90/Thy-1、CD133等干细胞表面标志物在三组细胞传代过程中表达率的变化情况。结果表明CD90的表达率在P0代细胞时,CD90+组为69.9%,CD90-组为0.4%,7721组为5.2%；其在P1、P2、P3、P4代细胞中分别为3.0%、2.3%、0.7%；1.1%、0.1%、1.0%；8.1%、4.4%、8.3%；6.7%、3.7%、7.4%。CD90+组中CD34表达率0.3%～7.8%,CD45：33.1%～96.0%,CD133：2.0%～59.1%；在7721组各标志物表达率分别为0.8%-11.2%、25.7%～53.2%和3.6%～13.6%；CD90-组为0.9%～12.3%、19.5%～70.0%和2.5%-11.1%。提示随着细胞传代,这些标志物的表达率存在着差异和波动,但各组表达率也逐渐趋于接近。免疫细胞化学染色显示分选后P1代CD90+组的AFP、GPC3与另外两组均呈阴性表达,CK18、PCNA与其它两组均阳性表达,组间无差异；CK19、Vimentin在SMMC-7721组与CD90-组中为阳性染色,而CD90+组为阴性。采用秩和检验分析CD90+组和CD90-组基因表达差异,表明单克隆培养所得细胞CD90+组与CD90-组间PTEN基因的表达差异有统计学意义(p=0.044),而AFP等7个基因以及传代培养所得两组细胞ANGPT等17个基因表达差异均无统计学意义(p>0.05)。结论：本研究结果初步表明,(1)免疫磁珠间接标记分选能够成功分离目的细胞,但分选时对低温、避光等环境条件要求比较严格,并且需要操作者有较丰富的经验,任何细节上的疏漏均会导致细胞回收率及纯化程度的降低,进而影响实验的进行。(2)肝癌细胞系7721中并非只有CD90阳性细胞具有自我更新及持续增殖的能力,CD90-细胞同样都具有持续增殖与多向分化能力,推测肝癌干细胞除CD90外,可能还表达其它表面标志物；(3)流式细胞仪分析、免疫细胞化学和基因表达分析提示,不同组细胞在单克隆培养及传代扩大培养过程中,部分克隆存在一定的差异,这种差异是否会引起不同克隆细胞侵袭性、致瘤性等生物学行为的改变,需要裸鼠体内移植实验的验证等更深入的研究工作。