一、研究意义控制中药材中黄曲霉毒素污染是解决中药材安全问题的核心,亟待解决。近些年,人们对中药材的需求量日益攀升,但中药材中黄曲霉毒素污染问题日益突出,将有可能对使用者的生命健康造成威胁。产毒黄曲霉菌属于曲霉属(Aspergillus)的一类多细胞微生物,广泛存在于空气、水、土壤等自然环境中,空气、水及昆虫等都能成为其传播途径,是中药材的主要污染菌。中药材被产毒黄曲霉菌污染后,产毒黄曲霉菌在适宜条件下将会大量繁殖并且产生黄曲霉毒素,而黄曲霉毒素产生后很难消除。因此,中药材中产毒黄曲霉菌的"预警监测"是从源头控制黄曲霉毒素污染及交叉污染的关键环节。黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)被世界卫生组织划定为I类致癌物,对人及动物肝脏组织具有严重的破坏作用,可造成肝癌、慢性肝炎、黄疽肝炎、肝肿大以及肝硬化,其中黄曲霉毒素B1毒性和致癌性最强也最为多见。近年来随着中药材应用量的攀增,研究人员在陈皮、杏仁、黄芪、地龙等多种中药材中发现了黄曲霉菌污染超标的现象,将有可能对使用安全造成严重威胁。因此,黄曲霉毒素污染是影响中药饮用安全的重要问题,亟待解决。二、国内外研究进展传统的产毒真菌分类鉴别一般采用形态学方法,但其要求鉴定者有较强的专业知识,并且存在鉴别准确率低、用时长等缺点,且鉴定者需较强的专业知识。而分子检测方法因其高度准确性,耗时短且客观性强等优点,在产毒真菌的种类检测和鉴定方面得到了深入的研究和广泛的应用。目前已报道的产毒黄曲霉菌分子检测方法包括D NA直接测序、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、多重PCR、荧光定量PC R等。但是,上述检测方法均耗时较长,一般需要2小时以上,其中DNA测序则需更长时间,无法满足当前大样本快速定性定量检测的要求。因此,针对目前产毒黄曲霉菌的检测,亟需一种更快速准确的定性定量方法。目前,广泛应用的黄曲霉毒素检测技术主要包括仪器分析方法和免疫学分析方法。仪器分析方法主要涉及薄层法、液相色谱法、气相色谱法和液质联用等,免疫学分析方法主要有酶联免疫分析和侧流层析检测技术及其产品。然而,仪器分析方法需要复杂的样本前处理,昂贵的仪器和具有大量专业知识的技术人员,无法同时检测大量样本。免疫分析方法虽然检测时间有所缩短,但仍然在2小时以上,且检测成本也较高。因此,亟需一种更快速、高效且成本低的检测技术应用于黄曲霉毒素的检测。三、研究目标1、建立"环介导等温扩增技术"快速检测中药材中产毒黄曲霉菌。2、建立"荧光偏振免疫分析技术"快速定性定量检测中药材中黄曲霉毒素B1。3、同步高通量定性定量检测中药材中产毒黄曲霉菌及黄曲霉毒素。四、研究内容与结果1、黄曲霉菌和中药材中其他真菌的培养与鉴定。利用黄曲霉菌选择培养基对中药材中的黄曲霉菌进行选择性培养,结合ITS条形码及形态鉴定方法系统鉴定为黄曲霉菌(Asperqillus flavus)。本研究通过PDA培养基培养中药材中其他真菌,结合IT S条形码及形态鉴定方法进行系统鉴定。2、建立了环介导等温扩增检测方法。本研究根据功能基因VER-1的外显子序列设计环介导等温扩增体系的扩增引物,并优化体系获得稳定高效的扩增结果,在此基础上结合实时荧光检测技术,成功建立了黄曲霉菌的实时环介导等温扩增方法。3、建立了荧光定量PCR检测方法。本研究通过对黄曲霉毒素生物合成关键基因设计特异引物,利用实时荧光定量PCR检测技术对黄曲霉菌进行定性定量检测。4、建立了荧光偏振免疫分析检测方法。本研究运用化学合成的方法,将黄曲霉毒素与氨基荧光素结合,得到能与黄曲霉毒素抗体结合且具有荧光信号的荧光标记物,并通过薄层色谱和质谱对合成产物进行确定。由于黄曲霉毒素和黄曲霉毒素荧光标记物与黄曲霉毒素抗体的结合存在相互竞争关系,并且与抗体结合前后分子量和旋转速度会发生变化,从而引起荧光偏振数值的变化。本研究根据该原理测得荧光偏振数值建立线性回归曲线,实现对黄曲霉毒素的定性定量检测。5、建立了 HPLC检测方法。本研究通过对黄曲霉毒素标准品的衍生化得到荧光信号更强更稳定的衍生化产物,并利用高效液相方法通过荧光检测器对其进行定性定量分析。6、完成四个不同环节的六味代表性中药材的72份样品的收集和对中药材样品中黄曲霉菌和黄曲霉毒素的检测。对采集得到的六味代表性中药材共72份样品,采用实时荧光环介导等温扩增技术和荧光定量PCR技术检测黄曲霉菌含量,采用荧光偏振和高效液相技术检测黄曲霉菌毒素的含量。