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家蚕细小病毒样病毒(Bombyx mori parvo-like virus china isolate,BmPLV)是首例动物二分病毒,病毒粒子表面无囊膜包裹,衣壳呈二十面体对称。BmPLV与细小病毒相比有三个显著的特征:一是该病毒的基因组为两个单链DNA分子(VD1,VD2),这两种核酸分子以单链线型方式(+VD1、-VD1、+VD2、-VD2)被分别包埋在各自的衣壳蛋白中；二是VD1和VD2末端拥有53 nt的共有序列,并且其末端的反向重复序列不形成回文结构；三是基因组具有编码DNA聚合酶的结构域。病毒结构蛋白的性质和组成决定了病毒衣壳结构及病毒粒子侵染特性,部分结构蛋白还能参与到病毒基因组的复制中。
家蚕细小病毒样病毒中国株(BmPLV-Z)VD2-ORF1,由3483 nt组成,编码病毒的结构蛋白,理论分子量为133 kDa,我们将其命名为P133。在细小病毒中,编码能力较强的衣壳蛋白基因会通过漏扫描或可变剪接等方式来产生多种结构蛋白,而不会直接产生分子量如133 kDa般大的结构蛋白。为了鉴定VD2-ORF1编码133 kDa的结构蛋白和了解P133在宿主细胞中的表达时相,本研究通过对VD2-OR目的3’末端933bp和5’末端1020 bp进行了克隆表达,并制备了P133N与P133C多克隆抗体,利用该抗体检测了病毒粒子中的结构蛋白P133,并对病毒结构蛋白P133在宿主体内的表达进行了研究,取得的研究成果如下:
1.P133氨基酸序列分析及相似性比对
通过NCBI Blastp软件,搜索结构蛋白P133相似性序列,结果显示,有六条同源序列,这六条同源序列均来自于呼肠孤病毒的结构蛋白。多序列比对结果显示,P133蛋白与这六种病毒的结构蛋白C端是具有相似性,而这些结构蛋白的C端都具有一些功能结构域,如CoCPV VP3的DNA结合序列。同时,丝氨酸蛋白酶与铜转运蛋白的C末端也与P133的C端有相似性。
2.P133 C端与N端的原核表达与多克隆抗体的制备
构建原核表达载体pET-28a-P133N和pET-28a-P133C,转化E.coli BL21菌株,利用IPTG诱导表达目的蛋白。Western blot与质谱鉴定结果显示,成功表达了家蚕细小病毒样病毒中国株(BmPLV-Z)P133的C端340 aa及N端311 aa的融合多肽。Ni-NTA纯化融合蛋白,分别制备了P133C和P133N多克隆抗体。
3.病毒粒子中结构蛋白P133的鉴定
分离纯化BmPLV-Z病毒粒子,SDS-PAGE分离病毒粒子结构蛋白,利用制备的P133C和P133N抗体分别对病毒粒子结构蛋白进行western blot分析。结果显示,这两种抗体在病毒粒子结构多肽中识别的蛋白条带大小相同,约133 kDa,证实P133确是病毒VD2-ORF1编码的结构蛋白；并且表明VD2-ORF1编码单一的结构蛋白。
4.病毒结构蛋白在中肠组织中的表达鉴定.
以感染病毒不同时间点的家蚕中肠组织为样本,分别以P133C、P133N抗体和VP为一抗,进行western blot分析。结果显示,P133在0-72小时内没有检测到印迹信号,而病毒的主要结构蛋白VP在感染后第48—72小时均能检测到印迹信号。