论文部分内容阅读
吉西他滨（Gemcitabine）是一种具有较高抗肿瘤活性的非天然核苷，在其在临床应用上存在脂溶性差、在血浆中半衰期短等不足之处。通过吉西他滨酰化反应获得比原药具有更高抗肿瘤活性的吉西他滨单酯，以解决上述问题。但是，当前吉西他滨的酰化反应主要选用化学法，存在区域选择性差、反应步骤琐碎、环境不友好等不足之处。迄今为止，仅有一篇酶促吉西他滨酰化反应的报道，且其底物最大转化率并不理想。基于上述情况，本论文首次探讨了酶促吉西他滨与不同羧酸乙烯酯进行区域选择性酰化反应的可行性，并对比研究了各因素对不同脂肪酶催化吉西他滨区域选择性酰化反应的影响，阐明了不同脂肪酶的催化特性；在此基础上，构建可用于高效、高区域选择性的合成吉西他滨单酯的生物催化反应体系。来于棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus的固定化脂肪酶Lipozyme TLIM和来于Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶Lipzyme RM IM均能在非水介质中选择性催化吉西他滨5’-羟基发生酰化反应。价格相对低廉的脂肪酶Lipozyme TLIM适合催化吉西他滨5’-中链脂肪酸酯的合成；脂肪酶Lipozyme RM IM在催化吉西他滨5’-长链脂肪酸酯时占据上风。适合脂肪酶Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM催化吉西他滨酰化反应的反应介质分别是30%（v/v）DMF-乙腈混合溶剂和30%（v/v）正戊醇-丙酮混合溶剂。在30%（v/v）DMF-乙腈混合溶剂中，脂肪酶Lipozyme TL IM催化吉西他滨月桂酰化反应的初速度和底物最大转化率随各因素的变化而改变，但其反应区域选择性几乎不变，始终高于99%。在所研究的范围内，30%（v/v）DMF-乙腈混合溶剂中最适初始水活度、吉西他滨浓度、两底物摩尔比、振荡速度和反应温度分别是：0.07、40mmol/L、1:9、45℃、200r/min。在此条件下，该酶促酰化反应的初速度和底物最大转化率分别为25.52mM/h和74.9%。在30%（v/v）正戊醇-丙酮混合溶剂中，脂肪酶Lipozyme RM IM催化吉西他滨硬脂酰化反应的初速度和底物最大转化率同样随各因素的变化而改变，但其反应区域选择性几乎不变，始终高于99%。在所研究的范围内，该酶促酰化反应在30%（v/v）正戊醇-丙酮混合溶剂中的最适初始水活度、两底物摩尔比、反应温度和振荡速度分别为：0.07、1:9、40℃、200r/min。在此条件下，该酶促酰化反应的初速度和底物最大转化率分别为10.13mM/h和83.1%。酰基供体结构对酶促吉西他滨区域选择性酰化反应的影响规律因酶不同而不同，对于脂肪酶Lipozyme TL IM而言，当酰基供体脂肪酸碳链的碳原子个数从2增加到12时，随着脂肪酸碳链的延长，该酶促酰化反应的初速度和底物最大转化率随之显著增加。当脂肪酸碳链长度（C12～C18）进一步加长时，随着脂肪酸碳链的延长，该酶促酰化反应的初速度和底物最大转化率随之降低。而对于脂肪酶Lipozyme RM IM而言，随着酰基供体脂肪酸碳链长度的延长，Lipozyme RM IM促吉西他滨区域选择性酰化反应的初速度和底物最大转化率逐渐增大。以这两种脂肪酶作为催化剂时，酰基供体脂肪酸碳链长度的改变对其区域选择性影响甚微。本研究不仅丰富了酶促酰化反应和非水相酶学的理论知识，还开辟了一条可用于吉西他滨高效、高区域选择性酰化反应的新途径。