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研究背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要类型,也是世界上最常见的恶性肿瘤之一。我国是世界上肝癌发病集中的国家,每年新发病例约占全球的45%,其死亡率居全球癌症死因的第3位,全国癌症死因的第2位,总体发病率和死亡率呈上升趋势。近年来,虽然针对肝癌的治疗手段不断更新,但肝癌治疗的总体疗效并无明显提高,复发和转移仍是影响肝癌患者预后的最主要因素。因此,寻找抑制肝癌浸润和转移的新方法有可能为肝癌的治疗带来福音。目的:初步研究HCV-E2刺激的肥大细胞源性外泌体可否抑制肝癌细胞的侵袭和转移,并探索其中涉及的可能机制。方法:第一部分工作:通过透射电子显微镜,western blot和纳米颗粒跟踪分析对肥大细胞源性外泌体进行鉴定,随后用荧光PKH67对外泌体进行标记,共聚焦显微镜下观察肥大细胞源性外泌体是否能被肝癌细胞内化。transwell迁移实验及transwell侵袭实验检测HCV-E2刺激的肥大细胞源性外泌体对肝癌细胞迁移及侵袭的影响,并western blot检测HCV-E2刺激的肝癌细胞中EGFR、磷酸化AKT和ERK1/2的表达。第二部分工作:应用miRNA微阵列技术鉴定,与非处理细胞相比,HCV-E2刺激的肥大细胞来源的外泌体中差异表达的miRNAs。依据差异表达miRNAs的变化倍数及文献报道的miRNA功能,筛选出miR-490作为候选研究对象,并采用qRT-PCR进行验证。将HCV-E2刺激的肥大细胞源性外泌体与肝癌细胞共培养,qRT-PCR检测肝癌细胞中miR-490表达。将miR-490 antagomir预转染的肥大细胞源性外泌体与肝癌细胞共培养,transwell迁移实验及transwell侵袭实验检测肝癌细胞迁移及侵袭。建立小鼠移植瘤肝癌动物模型,并用HCV-E2刺激的肥大细胞源性外泌体进行治疗后,计算肝癌转移的数量,IHC检测肝癌组织中EGFR的表达,qRT-PCR检测肝癌组织中miR-490的表达水平。结果:第一部分工作:外泌体可介导肿瘤细胞和肥大细胞之间相互作用。本研究中,我们从肥大细胞以及HCV-E2刺激的肥大细胞培养液中提取出外泌体,证实肥大细胞源性外泌体能够被受体肝癌细胞摄取。此外我们发现,相对于肥大细胞源性外泌体,HCV-E2刺激的肥大细胞(MCs)源性外泌体能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。第二部分工作:通过miRNA微阵列分析,我们鉴定了用或不用HCV-E2处理的肥大细胞源性的外泌体中差异性表达的19个miRNAs。本研究发现,HCV-E2不仅增加肥大细胞及其分泌的外泌体中miRNA-490的水平,而且还导致受体HepG2细胞中miRNA-490的水平升高,这最终降低了 ERK1/2途径的活性。在MCs中预先转染antagomiR-490显著性降低了肥大细胞、肥大细胞源性外泌体和受体HepG2细胞中miR-490的水平,并伴随着HepG2的转移增强,表明MCs源性的外泌体miR-490参与了 HepG2细胞转移的调节。动物模型结果显示,HCV-E2刺激的MCs来源的外泌体能够增加肝癌组织中miR-490表达,减少肿瘤大小及肝癌转移性肿瘤的发生。结论:HCV-E2刺激的肥大细胞源性外泌体能够抑制肝癌细胞转移,此过程是肥大细胞通过穿梭miR-490转移到肝癌细胞中抑制EGFR/ERK1/2途径而实现。