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胃癌是我国常见的致死性肿瘤之一,而胃癌细胞的多药耐药常常是导致胃癌患者治疗失败的最主要原因,明显降低了患者的总体生存率。因此,探究胃癌多药耐药的分子机制、寻找逆转耐药的途径就成为了肿瘤研究领域的一个重要方向。热休克蛋白(HSPs)是一类具有管家功能和分子伴侣功能的蛋白分子,广泛参与细胞的生长、发育、分化及基因转录等过程。在肿瘤细胞中,HSPs保护细胞免受凋亡的能力可促进肿瘤的发生发展。Hsp90β1作为一种新的亚型分子,是Hsp90β最主要的成员,我们前期研究发现,其在胃癌耐药细胞系中的表达常常是上调的,因此我们推测Hsp90β1与胃癌的多药耐药有关。 MicroRNAs是近年来发现的一类大小约21-25nt的内源性非编码小RNA,其通过与靶基因mRNA的3-UTR区互补结合,发挥抑制翻译或促进降解的作用,在转录后水平负性调控靶基因的表达。MiRNAs广泛参与了细胞分化、增殖以及肿瘤的发生、转移和耐药等多种生理病理过程。本课题组前期通过进行胃癌多药耐药表型相关miRNAs的高通量功能获得性筛选,发现了多个能明显逆转胃癌多药耐药的miRNAs,其中miR-23b-3p的作用最为明显。 有意思的是,在通过生物信息学软件对Hsp90β13–UTR区进行反向预测的结果中,我们发现了多个miRNA的结合位点,其中就有miR-23b-3p。于是我们再次利用生物信息学软件分析预测miR-23b-3p的下游靶基因,并筛选到了Hsp90β1和另外两个耐药经典分子ABCB1和BCL2。由此,我们可以推测胃癌耐药重要分子Hsp90β1可能介导miR-23b-3p对胃癌多药耐药的负性调控。基于这个问题,我们开展了本实验研究,深入探讨miR-23b-3p-Hsp90β1轴在胃癌多药耐药的生物学功能和分子机制。 【目的】 探讨miR-23b-3p-Hsp90β1轴在调控胃癌多药耐药中的生物学功能和分子机制。 【方法】 1、通过qRT-PCR和 Western Blot技术验证胃癌耐药细胞系 SGC7901/VCR、SGC7901/ADR与其亲本细胞系SGC7901中Hsp90β1的mRNA和蛋白表达水平的差异;并利用MTT药敏实验、流式细胞术和药物蓄积实验检测转染Hsp90β1的inhibitor后各个细胞系中的药物敏感性、细胞凋亡状况及药物泵出率。 2、通过qRT-PCR和Western Blot检测Hsp90β1对耐药经典分子ABCB1和BCL2的影响。 3、通过qRT-PCR技术检测比较三种胃癌细胞系中miR-23b-3p表达水平的差异;利用多个细胞功能试验(MTT药敏实验、流式细胞法、药物蓄积实验)检测转染miR-23b-3p inhibitor和mimic后各个细胞系中的药物敏感性、细胞凋亡状况及药物泵出率。 4、结合本课题组前期研究结果,通过生物信息学方法预测miR-23b-3p可能的靶基因,并通过荧光素酶基因报告实验验证。 5、qRT-PCR和Western Blot检测转染miR-23b-3p的inhibitor和mimic后各个细胞系中Hsp90β1、ABCB1和BCL2的mRNA和蛋白表达水平。 【结果】 1、 Hsp90β1在胃癌耐药细胞中的表达水平增高,干扰Hsp90β1表达可提高胃癌耐药细胞的药物敏感性胞内药物蓄积量 相比于胃癌亲本细胞系SGC7901,耐药细胞系SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中Hsp90β1的表达水平是增高的。在下调了Hsp90β1表达后,一方面胃癌耐药细胞系对化疗药物5-氟尿嘧啶、长春新碱及顺铂的敏感性增强;另一方面胃癌耐药细胞对5-氟尿嘧啶所诱导的细胞凋亡率亦明显增加;此外,胃癌耐药细胞内的药物蓄积量亦增加。提示Hsp90β1可促进胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的耐药性。 2、ABCB1和BCL2是伴侣分子Hsp90β1的下游作用分子 在干扰了胃癌耐药细胞系中Hsp90β1表达的基础上分别通过qRT-PCR和Western blot实验检测了ABCB1和BCL2的mRNA和蛋白表达水平,结果发现:在干扰掉SGC7901/VCR和SGC7901/ADR细胞系中的Hsp90β1后,ABCB1和BCL2的mRNA和蛋白表达均降低。说明Hsp90β1可以通过对ABCB1和BCL2的调控影响胃癌多药耐药。 3、miR-23b-3p低表达于胃癌耐药细胞,上调miR-23b-3p表达可提高胃癌耐药细胞的药物敏感性和胞内药物蓄积量 qRT-PCR实验表明胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中miR-23b-3p的表达水平显著低于亲本细胞系SGC7901。在改变了细胞内miR-23b-3p的表达水平后进行了耐药相关功能试验,结果表明:过表达miR-23b-3p后,耐药细胞系SGC7901/VCR和SGC7901/ADR对化疗药物的敏感性增强,并且对5-FU所诱导的凋亡明显增加,细胞内的药物蓄积量亦增加。 4、Hsp90β1、ABCB1和BCL2是miR-23b-3p的直接靶基因 经生物信息学分析,初步确定 Hsp90β1、ABCB1和BCL-2为 miR-23b-3p的潜在靶基因。qRT-PCR和Western blot实验结果发现:当下调胃癌亲本细胞SGC7901的miR-23b-3p表达后,Hsp90β1、ABCB1和BCL2的表达水平显著增高;而上调耐药细胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的miR-23b-3p表达后,Hsp90β1、ABCB1和BCL2的表达明显降低。荧光素酶报告基因实验证明miR-23b-3p可与这三种基因的3’-UTR区靶向结合。 【结论】 1、Hsp90β1可以通过调控耐药经典分子ABCB1和BCL2的表达参与胃癌多药耐药。 2、Hsp90β1介导miR-23b-3p对胃癌多药耐药的负性调控。 3、miR-23b-3p可直接调控ABCB1和BCL2从而参与胃癌多药耐药。