鸡降钙素基因重组质粒的构建及其在蛋鸡体内的表达研究

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降钙素是动物体内钙磷调节的主要激素之一。降钙素的主要生理作用是抑制破骨细胞来调节人和动物体内钙的代谢。因此被广泛的应用于治疗各骨病例如Paget氏病和各种原因引起的高血钙症以及原发性骨质疏松症。但是由于现在临床上用的降钙素大都是鲑鱼或者猪的组织提取出来的,所以一般价格昂贵。尽管现在利用基因工程技术将降钙素基因在原核细胞中进行表达,但在实际应用中还具有非常大的局限性。因此,本研究拟利用分子生物学技术构建鸡降钙素基因的真核表达质粒,在鸡体内进行表达并以此来对禽体内钙的营养调控机制进行研究,并进一步寻找利用基因注射来解决生产中由于的钙的营养不足而引起的各种缺乏症的可行性。本研究就是通过已知的鸡降钙素基因序列设计引物,用逆转录多聚酶链反应扩增出鸡降钙素cDNA,将其插入真核表达载体pCEP4和pcDNA3中构建鸡降钙素基因的真核表达质粒,经酶切和PCR鉴定,确定得到了cCT的真核表达重组质粒pCEP4-CT和pcDNA3-CT。将获得的两种真核表达质粒纯化后对蛋鸡进行腿部肌肉注射,两周后进行重复一次,并每两周都取血液样品,对血液中的降钙素、甲状旁腺素、雌二醇及其血钙血磷进行测定分析,根据体内降钙素以及其他相关的激素和生理指标的变化来检验两个重组的真核表达质粒在蛋鸡体内的表达情况。 通过本次实验得到的结果显示: 1、扩增出来的cDNA,通过序列测定结果表明和国外已经发表的鸡的降钙素cDNA序列仅有一个核苷酸的差别,中间没有缺失和插入的现象。证明所得到的是鸡的降钙素cDNA。 2、所获得的鸡降钙素cDNA分别连入真核表达载体pCEP4和pcDNA3中,对筛选出的质粒进行酶切和PCR鉴定,证明得到了重组的鸡降钙素基因真核表达质粒。 3、蛋鸡体内表达实验结果表明注射所构建的的两种重组鸡降钙素质粒后,和对照组相比血液中的降钙素显著的上升(p<0.05),血钙有明显的下降而甲状旁腺素、雌二醇以及血磷则都有明显的增高趋势。结果表明所构建的质粒在蛋鸡体内的作用效果明显。 4、同时在实验中证明,所构建的两个真核表达质粒pCEP4-cCT和pcDNA3-cCT相比较,前者的持续表达时间要长于后者。
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