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本项课题根据日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库中cDNA序列和部分EST预测功能基因片段,发现在日本七鳃鳗口腔腺大量存在中性粒细胞抑制因子(NIF)样蛋白质,命名为1251。L251属于CAP蛋白超家族(CRISPs,Antigen 5 proteins, Pathogenesis-related proteins)、PR-1蛋白亚家族成员,在结构上具有三个区域: PR-1结构域、一个铰链区,一个半胱氨酸丰富结构域(CRD)。通过大量相关蛋白结构与功能的分析与比对,得出L251蛋白的PR-1亚家族中NIF具有相同的保守序列和功能位点。根据序列特异性和酶切位点设计特异性引物,将L251功能基因从cDNA文库中钓取全长基因,并连接到pET23b表达载体,转化到大肠肝菌BL21表达菌中重组表达,产物经亲和层析纯化得到蛋白质包涵体。通过蛋白质变性和复性,用MIGRA test试剂盒对抑制中性粒细胞(neutrophil)跨内皮细胞迁移活性进行检测。实验结果表明:在fMLP诱导的中性粒细胞趋化反应中,L251在118nM浓度可抑制75%的中性粒细胞迁移。此外用荧光染料DHRl23标记中性粒细胞,当用1251处理后,发现由fMLP活化的中性粒细胞呼吸爆发的平均荧光强度最大程度可由55.84下降至16.09。为研究1251抑制中性粒细胞生理活性的机理,将中性粒细胞分别与CDlla、CDllb和CDllc FITC标记单克隆抗体孵育来检测中性粒细胞表面整合素表达情况,在L251蛋白存在时,中性粒细胞表面整合素表达量有不同程度的减少(P<0.05),通过流式细胞仪对中性粒细胞前散射和旁散射信号分析,可观测到L251引起粒细胞的大小及颗粒度均发生变化。由此可知L251蛋白在同本七鳃鳗在营寄生生活时于口腔腺分泌液中大量存在的必要性:L251蛋白通过趋化因子模拟机制与CDllb/CDl8整合素的特异性结合,干扰趋化性细胞因子引发的中性粒细胞正常生理反应。日本七鳃鳗是继微生物、病毒、蠕虫和人类肿瘤之后又一具有免疫逃逸机制的新物种;其口腔腺分泌L251蛋白具有多种免疫调节活性,是具有我国自主知识产权的新的免疫抑制剂;已经鉴定出L251蛋白中性粒细胞抑制活性是迄今为止发现的除狗钩虫中NIF之外的世界上第二条外在中性粒细胞抑制因子样蛋白。L251蛋白全部免疫调节活性的确定将为我国免疫调节剂的药物开发做出巨大贡献。