核糖核酸酶抑制因子（Ribonuclease Inhibitor，RJ）是一种酸性糖蛋白，分子量约为50KDa。RI是核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A）的抑制剂(ki=4.0×10^-14M)，可以有效地抑制其对RNA的水解作用。对于RI功能的研究，最初假设其参与调节细胞内的RNA水平，由于RI并不是对所有的RNase都有抑制作用，因此这个假设并不能代表其主要作用。另一个功能是其对血管生长因子（Angiogenin，Ang）的抑制作用。Ang是由肿瘤细胞和正常细胞分泌的分子量为14.4kDa的蛋白质，在体内和体外均具有强烈的诱发血管生成的活性。Ang在组织和细胞中的分布十分广泛。培养的结肠癌细胞、肝癌细胞中可检测到Ang的存在。在胃腺癌、结肠腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌组织中也有表达。Ang还存在于正常组织细胞中，如血浆、肾细胞、上皮细胞、血管平滑肌细胞、血管上皮细胞、成纤维细胞等。Ang的广泛性，提示其在体内可能受到严格的调控。根据cDNA序列分析，Ang与RNase A有35％的同源性；但Ang与RI有更大的亲和力(ki=7.1×10^-16M)。X射线分析表明，Ang与RNase A有着极其相似的立体结构，二者都可以与人胎盘RI紧密结合。由于RI可以与Ang形成紧密的结合，从而可以抑制其促血管生成的活性。 大量实验表明，新生血管的生成对于肿瘤的生长和转移是必须的；并且外源性限制血管的生成可以明显地抑制肿瘤的生长，甚至可以使肿瘤消退。因此Folkman从其开创性的研究中提出假说认为，阻断肿瘤的血管形成就可以阻止肿瘤的生长。至今为止，已有很多的血管阻断剂被发现。但应用这些阻断剂一个明显的不足是需要高浓度的阻断剂才可以有效地抑制肿瘤的生长，而这些阻断剂又因为复杂的提取过程，在应用上受到限制。基因治疗可以在一定程度上解决这个问题。所谓基因治疗是指，用一定的方法将外源基因导入目的细胞中，使之在体内长期进行表达，从而达到治疗的目的。造血细胞作为基因治疗的靶细胞具有以下优点：①取材容易，来源于患者自体或脐带血。目前研究发现，人脐带血是造血干/祖细胞的丰富来源，具有早期祖细胞含量高，干/祖细胞体外增殖能力强和移植物抗宿主病发病率低等优点，是基因治疗理想的靶细胞;②自我更新能力强，利于基因长期、稳定的表达;③易于体外培养;④易于植回患者体内并存活。关于RJ的抗肿瘤研究，我们实验室己经进行了大量的工作。我们从人胎盘中和猪肝中提取班，给予荷瘤小鼠后可以抑制乳腺癌实体瘤Ca761，肉瘤5 180，肝癌实体瘤H22的生长。并通过实验证实恶性肿瘤患者红细胞中RJ活性下降，瘤组织内ri基因表达下降。 本研究的目的在于，应用逆转录病毒载体系统，将人核糖核酸酶抑制因子基因转移到小鼠骨髓造血细胞中，使其在骨髓细胞中得到高表达;进而将表达班的骨髓细胞移植给经Y射线照射的小鼠，希望RJ基因在小鼠体内长期表达，从而可以通过抑制肿瘤的血管形成这一途径抑制种植在小鼠皮下黑色素瘤的生长。同时本研究分析了逆转录病毒对小鼠造血细胞和人CD34+的转染效率及本转染系统的安全性。为此做了以下的一些工作。 1.用脂质体的方法将含有人核糖核酸酶抑制因子基因的重组逆转录病毒载体pLNCX一ri转入逆转录病毒包装细胞PA317中，经G418筛选，得到阳性克隆，进而用小鼠成纤维细胞ND注3T3测定病毒滴度，分别得到滴度为6x1O4CFU/ml的产空质粒病毒细胞克隆和滴度为2.5、1护CFU/而的产重组质粒病毒的细胞克隆。 2.辅助病毒分析表明，该转染系统无辅助病毒的污染，用病毒感染后的ND注3T3细胞培养上清再培养Nlll3T3细胞，无抗G418的抗性克隆产生，说明该转染系统是安全可靠的。 3.基因治疗的关键和难点是转染系统的转染效率，本研究通过体外和体内两条途径分析了逆转录病毒对小鼠骨髓造血细胞的转染效率，同时也分析了逆转录病毒对人脐血CD34十细胞的体外转染效率。研究结果显示，逆转录病毒对小鼠骨髓细胞的体外转染效率为35%一40%;将体外筛选后的骨髓细胞移植给小鼠后，一个月后体内的表达效率为70%。而逆转录病毒对人CD34+细饱的体外转染效率为 17%一20%。 4.对进行了骨髓移植的小鼠，检测其骨髓、血液、脾脏、胸腺、肝脏中外源基因的表达情况。用PCR和RT一PCR均可以检测到ri基因在上述组织中的存在， 同时用Westem一lot的方法检测到IU在骨髓、脾脏、血液中均有表达。荧光免疫 的方法检测到IU在骨髓细胞和血液细胞中均有高表达。用EUSA的方法对血液中 的犯进行了动态的观察，发现小鼠血中的租在移植后的第犯天表达达到最高值。 5.将小鼠黑色素瘤细胞B16分别接种在Y射线照射但不移植骨髓的小鼠、移 植非转染细胞的小鼠、移植转染空质粒的小鼠、移植转染ri基因的小鼠皮下。观 察RI是否可以抑制肿瘤的生长。结果表明，移植了转染ri基因骨髓细胞的小鼠与其他三个对照组相比，成瘤潜伏期延长，肿瘤生长明显减慢，瘤重减轻，瘤组织中的血管密度降低。说明RI可以通过抑制肿瘤血管生成的途径抑制肿瘤的生长。 上述研究结果表明，应用逆转录病毒转染系统可以有效地将人核糖核?