四逆汤是《伤寒论》的经典药方,由附子、干姜和甘草组成。四逆汤组方精良,配伍严谨。现代药理研究表明,四逆汤在心、脑血管疾病的预防和临床治疗中表现出独特的优势和作用特点。附子是四逆汤的君药,主要含有生物碱类成分;干姜主要含挥发油成分和二本庚烷、姜辣素类等不挥发成分;甘草主要含三萜皂苷和黄酮成分。《伤寒论》中四逆汤君药采用的是生附子,其所含双酯型乌头碱是剧毒生物碱,有必要建立合理的监测方法,检测汤剂的毒性,保证四逆汤临床用药安全。同时,为保证汤剂临床用药有效,还必须对汤剂中的其他有效成分提供可靠的检测方法。四逆汤的运用从古至今,在煎煮工艺上产生了比较大的差异,有必要对传统煎煮技术和现代机械煎煮进行比较,考察合理的煎煮工艺条件。四逆汤在处方配比上也发生了较大变化,有必要对传统汤剂和现代药典成方制剂进行药效评价。本课题研究主要研究内容包括以下几方面:一、四逆汤中双酯型生物碱是其中最主要的毒性成分,目前在高效液相对双酯型生物碱定量所采用的色谱条件大多是在强碱条件下,或者是利用反向离子对色谱法进行定量研究,这两种方法都会对色谱柱造成不可逆的破坏,本文建立的双酯型生物碱含量测定方法的条件温和,利于色谱柱的长期使用。2010年版《中国药典》所收载四逆汤含量测定项下仅检测甘草酸单一指标性成分,对于君药附子以及干姜中的成分均未涉及,本实验设计了RP-HPLC方法同时检测四逆汤中附子中苯甲酰新乌头原碱,干姜中6-姜酚,炙甘草中甘草苷和甘草酸的含量,为控制汤剂的质量提供了可靠的检测方法。二、四逆汤水提取工艺的优化:2010年版《中国药典》所收载四逆汤含量测定项下仅检测甘草酸单一指标性成分,本文以苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸、6-姜酚和浸出物的重量为考核指标,优选四逆汤最佳煎煮工艺,分别采用了传统的砂锅煎煮和常压煎药机煎煮两种煎煮方法,分别考察了浸泡时间、煎煮时间、加水倍量和煎煮次数对四逆汤中各成分含量的影响,得到标准汤剂的最佳煎煮工艺为:浸泡时间为60min,煎煮时间为60 min,加水倍量为10倍,煎煮2次。三、四逆汤出自经方《伤寒论》,其处方配比为:附子:干姜:甘草=5:2:3,而在2010版《中国药典》四逆汤成方制剂中所采用的附子为炮制品(淡附片),处方配比为:淡附片:干姜:甘草=3:2:3,同时煎煮工艺也发生了较大的变化:传统四逆汤是一锅共煎,没有先煎后下的特殊煎煮方法,但在2010版《中国药典》中干姜采用了挥发油提取的方法提取挥发油,加入到最后的四逆汤中。通过以上比较发现,传统四逆汤和药典制剂在处方配比和煎煮的工艺都发生了巨大的差异,有必要对两种汤剂的药效进行评价,本文采用了给予小鼠灌胃传统四逆汤和药典制剂的四逆汤,观察小鼠在常压缺氧条件下的存活时间和冰水游泳的持续时间,结果显示四逆汤传统汤剂和药典制剂都能显著延长小鼠在常压缺氧条件下的存活时间和冰水游泳的持续时间。并分别测定了给药后小鼠血浆中SOD的活力和MDA的含量以及小鼠血浆中NO、ET-1的含量。研究结果显示:小鼠灌服四逆汤传统汤剂和药典制剂均能提高血浆中SOD的活力,减少过氧化反应,MDA含量降低,保护机体减少损伤;传统汤剂和药典制剂均能能显著提高小鼠的耐缺氧能力(P<0.01),可以显著延长小鼠在常压缺氧条件下的存活时间;四逆汤传统汤剂和药典制剂能显著提高小鼠低温条件下的游泳时间(p<0.01)。可以显著延长小鼠在低温条件下的存活能力。连续灌服四逆汤传统汤剂和药典制剂的小鼠在冰水游泳后,血浆中NO含量增加和ET-1含量减少说明四逆汤对小鼠血压稳定的机制可能与调节小鼠体内NO和ET-1有关。