宫颈癌(CC)是最常见的妇科癌症之一,据2018年全球癌症统计数据,宫颈癌的发病率和死亡率在女性中均排在第四位,其中发病率为6.6%,死亡率达7.5%,大约31.1万女性死于宫颈癌。宫颈癌在全球范围内呈现迅速增长,在女性新增癌症例数中排第二位。在中国,宫颈癌的发病率和死亡率明显高于西方等国家,每年约有3万余女性死于宫颈癌。据统计,国际妇产科联合会(FIGO)I期患者的生存率约为80-98%,但当宫颈癌发生转移时,患者存活率显著降低至50%。尽管许多患者在手术或放化疗后获益,但宫颈癌的复发率和转移率仍然很高(约29%至38%),并且是患者死亡的主要原因。宫颈癌的侵袭和转移与很多信号通路及分子相关联,但目前的研究都处于基础起步阶段,具体的调控机制仍不清楚。因此,研究宫颈癌侵袭及转移的机制对临床治疗具有很重要的意义。人类FAT1基因是Fat钙粘蛋白家族成员之一,为果蝇ft2的同源基因。我们前期研究发现FAT1在宫颈癌中突变率为8.8%。Fat钙粘蛋白家族主要与组织生长发育,细胞平面极性及细胞迁移相关。虽然大多数人上皮细胞中FAT1 mRNA表达水平相对较低,但FAT1异常缺失可能与一系列遗传性疾病有关,例如4q-综合征,双相情感障碍等。同时,发育相关基因的异常通常与肿瘤发病机制相关。目前研究提示FAT1与多种恶性肿瘤的发生发展相关,在人类癌细胞中表达水平各不相同,且在不同肿瘤中可通过不同通路(如Hippo,Wnt和MAPK/ERK信号通路)发挥抑癌基因或者癌基因的作用。通常在上皮来源的肿瘤中FAT1是抑癌基因,如口腔癌和头颈部鳞状细胞癌;在黑色素瘤,急性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病中FAT1起着致癌基因的作用。但FAT1在宫颈癌中的作用和机制尚不明确。在本研究中我们检查了FAT1在宫颈癌样品中的表达水平,并探索FAT1对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响及机制,为降低宫颈癌患者复发或是转移提供新的策略,为宫颈癌的基因靶向治疗提供新的途径。研究方法1.采用qRT-PCR及免疫组织化学法检测宫颈癌患者癌组织及癌旁的正常宫颈组织中FAT1的mRNA及蛋白表达情况。收集的40例宫颈癌组织标本及癌旁组织标本来源于2016年1月至2017年7月期间在陆军军医大学第一附属医院妇科接受治疗的宫颈癌住院患者。应用qRT-PCR及免疫组织化学法检测癌组织及癌旁组织中FAT1 mRNA及蛋白表达水平。同时探讨FAT1mRNA表达与临床病理特征的相关性。2.构建针对人FAT1基因的小干扰RNA(siRNA)及表达载体,转染宫颈癌HeLa及C33A细胞系,观察基因沉默作用。构建3条siRNA寡聚体及阴性对照(NC),筛选出干扰效率最高的1条siRNA片段,转染2种宫颈癌细胞系后,采用CCK-8于0、12、24、48小时测量450nm OD值,观察宫颈癌细胞增殖水平的改变。应用Transwell迁移和侵袭实验观察FAT1沉默后对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响。3.构建针对人FAT1基因的过表达载体,转染宫颈癌Hela及C33A细胞系,观察FAT1基因过表达对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。因FAT1基因过长难以操作,参照Morris等报道,建立包含N末端、2个cadherin区域、5个EGF重复区域以及穿膜区域、胞内段的FAT1截短型cDNA片段,其被命名为FATI-TRUNC,从而构建FAT1基因的过表达载体pcDNA3.1-FAT1。用过表达载体转染2种宫颈癌细胞系后,采用CCK-8,Transwell迁移和侵袭实验观察过表达FAT1后对宫颈癌细胞增殖,迁移和侵袭的影响。4.检测上皮间质转化(EMT)相关标志物水平来观察FAT1对宫颈癌EMT的影响。分别沉默和过表达FAT1后,检测EMT相关基因(间质特征基因如波形蛋白(VIM),上皮特征基因E-cadherin(CDH1))的表达变化。以及这种调控机制能否被过表达β-catenin蛋白所逆转。5.探索FAT1是否通过Wnt/β-catenin信号通路调控宫颈癌细胞生物学行为。调控FAT1表达后,采用Western blot检测β-catenin蛋白总表达量及磷酸化β-catenin蛋白表达量,检测Wnt通路下游靶基因(TCF-4,c-Myc,MMP14)表达水平。应用免疫共沉淀实验检测FAT1是否直接与β-catenin结合。过表达FAT1同时过表达β-catenin,观察FAT1对宫颈癌细胞的影响能否被过表达β-catenin所逆转。检测EMT相关基因(间质特征基因如波形蛋白(VIM),上皮特征基因E-cadherin(CDH1))的表达变化,观察宫颈癌EMT是否也是通过Wnt信号通路,以及这种调控机制能否被过表达β-catenin蛋白所逆转。统计学处理采用SPSS 17.0软件(SPSS,Chicago,IL,USA)进行统计学分析。数据以均数±标准误(Mean±SE)的方式表示。students T检验用于比较两组之间的差异,单因素方差分析以比较两组以上的数据。P值小于0.05为差异具有统计学意义。每个实验均重复3次。研究结果1.40例宫颈癌组织及癌旁组织标本中,FAT1在宫颈癌组织中表达水平明显低于癌旁组织(p<0.05)。同时,统计分析显示宫颈癌中FAT1蛋白的表达水平与淋巴转移及脉管浸润呈负相关。2.成功合成了针对FAT1的siRNA并筛选出干扰效率最高的siRNA片段。沉默FAT1基因表达后,Hela及C33A细胞体外增殖速度增加。同时2种宫颈癌细胞系的侵袭和转移能力增加。3.成功构建了FAT1过表达质粒pcDNA3.1-FAT1。过表达FAT1基因后,Hela及C33A细胞体外增殖速度明显下降,克隆形成能力下降,侵袭和转移的能力也下降明显。4.过表达FAT1后,EMT相关的间质特征蛋白vimentin,转录因子Twist表达降低,上皮特征蛋白E-cadherin表达升高;沉默FAT1后结果相反。5.敲低FAT1基因可增加宫颈癌细胞中总的β-catenin水平,而磷酸化β-catenin(pβ-catenin)水平降低。同时,敲低FAT1可升高宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin通路下游靶基因的表达水平。与之相反,过表达FAT1基因降低宫颈癌细胞中总的β-catenin水平,磷酸化β-catenin(p-β-catenin)水平升高,Wnt/β-catenin通路下游靶基因的表达水平降低。免疫共沉淀显示内源性及外源性FAT1可与β-catenin结合。6.过表达β-catenin和FAT1显示pcDNA3.1-β-catenin/Adv.Flag-FAT1组的β-catenin,c-Myc,TCF-4,MMP-14,twist与vimentin表达水平高于pcDNA3.1–vector/Adv.FlagFAT1组,pcDNA3.1-β-catenin/Adv.Flag-FAT1组细胞增殖效率,侵袭和迁移能力高于pcDNA3.1–vector/Adv.Flag-FAT1组,提示β-catenin可以部分逆转FAT1对Wnt通路的作用。过表达β-catenin和FAT1结果提示FAT1可通过Wnt/β-catenin调控EMT,并且β-catenin可部分逆转FAT1对EMT的调控作用。研究结论1.FAT1mRNA及蛋白表达水平在宫颈癌组织中较癌旁组织明显降低,并且FAT1蛋白的表达水平的降低与淋巴转移、及脉管浸润有关,提示FAT1表达异常可能与宫颈癌恶性生物学行为相关。2.体外实验提示FAT1高表达可抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭、转移及EMT,而RNA干扰敲低FAT1的表达则促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭、转移及EMT。并且发现FAT1通过与β-catenin结合,促进β-catenin的磷酸化及降解,进而抑制其核转位效应来抑制Wnt/β-catenin信号通路。证明了FAT1高表达通过Wnt/β-catenin信号通路对宫颈癌细胞增殖、侵袭和转移的抑制作用,具有一定的临床指导意义。3.FAT1可通过Wnt/β-catenin通路调控宫颈癌EMT,提示FAT1可能参与了宫颈癌发生转移的过程,可能为宫颈癌复发及转移的治疗提供了新的靶点。