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禽流感(avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的禽类感染和/或疾病的综合征。AIV的非结构蛋白NS1是一个多功能调控因子仅在感染的宿主细胞中合成,在调控病毒致病性和毒力,影响宿主细胞免疫反应以及凋亡等多个方面具有重要作用。我们之前已经证实了H9N2WN毒株的NS1蛋白可以诱导MDCK和293细胞发生凋亡,NS1蛋白的突变通常会引起其功能的改变,为进一步研究NS1蛋白对诱导细胞凋亡方面功能,本研究将H9N2WN毒株的NS1蛋白的6个重要的氨基酸位点进行定点突变,探索这些突变对NS1蛋白诱导宿主细胞凋亡的影响。研究结果如下:1H9N2AIV可以诱导DF-1细胞发生凋亡。在显微镜下观察AIV感染的DF-1细胞出现典型的病变现象;用Hoechst染料染色后在荧光显微镜下发现一些细胞核致密浓染,有的呈碎块状;琼脂糖凝胶电泳结果显示,使用0.5MOI的AIV感染就可以使细胞的DNA出现明显的片段化现象,且DNA片段化的程度随着病毒感染剂量增加或感染时间的延长而加剧。2成功构建了H9N2WN毒株的NS1蛋白6个突变体的真核表达载体。使用FastMutagenesis System将NS1蛋白的42位、58位、73位、92位、191位以及206位氨基酸进行定点突变,构建了重组质粒pEGFP-NS1-42、pEGFP-NS1-58、pEGFP-NS1-73、pEGFP-NS1-92、pEGFP-NS1-191以及pEGFP-NS1-206;将NS1蛋白及其突变体的真核表达载体转染到DF-1细胞24h后,在激光共聚焦下观察NS1蛋白及其突变体的亚细胞定位,蛋白分布没有明显差异,表明H9N2WN毒株的NS1蛋白这6个位点氨基酸的突变对其亚细胞定位没有影响。3流式细胞术检测结果显示H9N2WN毒株的NS1蛋白6个氨基酸位点的突变均不同程度的降低了NS1蛋白诱导DF-1细胞的凋亡率,尤其是191位的突变差异极显著(P<0.01)。Caspase活性检测和Western blotting检测结果均显示H9N2WN毒株NS1蛋白191位氨基酸的突变能够降低NS1蛋白Caspase-3,9活化程度和蛋白表达量,表明NS1蛋白191位氨基酸的突变会降低NS1蛋白诱导宿主的凋亡作用。综上所述,本研究证实了H9N2AIV可以诱导DF-1细胞发生凋亡,且NS1蛋白191位氨基酸的突变显著降低了其诱导细胞凋亡的作用,为NS1蛋白诱导细胞凋亡功能方面的研究提供了理论基础。