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禽流感（avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类感染和/或疾病的综合征。AIV的非结构蛋白NS1是一个多功能调控因子仅在感染的宿主细胞中合成，在调控病毒致病性和毒力，影响宿主细胞免疫反应以及凋亡等多个方面具有重要作用。我们之前已经证实了H9N2WN毒株的NS1蛋白可以诱导MDCK和293细胞发生凋亡，NS1蛋白的突变通常会引起其功能的改变，为进一步研究NS1蛋白对诱导细胞凋亡方面功能，本研究将H9N2WN毒株的NS1蛋白的6个重要的氨基酸位点进行定点突变，探索这些突变对NS1蛋白诱导宿主细胞凋亡的影响。研究结果如下：1H9N2AIV可以诱导DF-1细胞发生凋亡。在显微镜下观察AIV感染的DF-1细胞出现典型的病变现象；用Hoechst染料染色后在荧光显微镜下发现一些细胞核致密浓染，有的呈碎块状；琼脂糖凝胶电泳结果显示，使用0.5MOI的AIV感染就可以使细胞的DNA出现明显的片段化现象，且DNA片段化的程度随着病毒感染剂量增加或感染时间的延长而加剧。2成功构建了H9N2WN毒株的NS1蛋白6个突变体的真核表达载体。使用FastMutagenesis System将NS1蛋白的42位、58位、73位、92位、191位以及206位氨基酸进行定点突变，构建了重组质粒pEGFP-NS1-42、pEGFP-NS1-58、pEGFP-NS1-73、pEGFP-NS1-92、pEGFP-NS1-191以及pEGFP-NS1-206；将NS1蛋白及其突变体的真核表达载体转染到DF-1细胞24h后，在激光共聚焦下观察NS1蛋白及其突变体的亚细胞定位，蛋白分布没有明显差异，表明H9N2WN毒株的NS1蛋白这6个位点氨基酸的突变对其亚细胞定位没有影响。3流式细胞术检测结果显示H9N2WN毒株的NS1蛋白6个氨基酸位点的突变均不同程度的降低了NS1蛋白诱导DF-1细胞的凋亡率，尤其是191位的突变差异极显著（P＜0.01）。Caspase活性检测和Western blotting检测结果均显示H9N2WN毒株NS1蛋白191位氨基酸的突变能够降低NS1蛋白Caspase-3，9活化程度和蛋白表达量，表明NS1蛋白191位氨基酸的突变会降低NS1蛋白诱导宿主的凋亡作用。综上所述，本研究证实了H9N2AIV可以诱导DF-1细胞发生凋亡，且NS1蛋白191位氨基酸的突变显著降低了其诱导细胞凋亡的作用，为NS1蛋白诱导细胞凋亡功能方面的研究提供了理论基础。