研究背景：艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),它是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)引起的一种病死率极高的恶性传染病。HIV病毒侵入人体后会持续复制和传播,逐步导致CD4+细胞的减少以及人体免疫系统的破坏,从而并发一系列机会性感染以及肿瘤。根据联合国艾滋病规划署最新的数据显示,截至2011年末,全世界共有3420万名HIV感染者。我国艾滋病的防治工作也处于非常关键的时期,根据卫生部的统计,截至2012年10月底,全国累计报告艾滋病病毒感染者和病人492191例,存活的感染者和病人383285例。由于全世界每年在HIV/AIDS患者治疗上的投入不断增加以及高效抗逆转录病毒治疗方法(Highly active antiretroviral therapy, HAART)的普及应用,艾滋病已经成为一种可控的慢性疾病。同时由于艾滋病人的寿命延长,死亡率大大下降,感染者或发病者所面临的各种并发症就极大的影响了病人的生存质量。眼部疾病是HIV/AIDS患者常见的并发症,流行病学研究表明,大约50%-75%的HIV感染者合并有眼部病变。HIV视网膜病变是HIV/AIDS患者常见的眼部病变之一,该病发生较早,甚至有少数患者作为首发症状就医；累及人群广泛,发病率与CD4+细胞的数量密切关联,CD4+T淋巴细胞的数量越少,视网膜病变的发病率就越高。HIV视网膜病变可以表现为后极部的棉絮状白斑、视网膜出血、毛细血管瘤、血管扩张、视网膜坏死以及视网膜脱落等。其病理特征包括视网膜微血管渗漏、神经节细胞凋亡、内皮细胞肿胀、基底膜增厚等。视网膜病变可以导致HIV/AIDS患者的视力受损,严重的患者甚至会因此而失明,从而给患者的生活质量带来了很大的影响。研究表明在HIV感染者的视网膜血管内皮细胞、视网膜组织内部的各层细胞中均能检测到HIV的抗原,因此,HIV侵入视网膜结构被认为是导致HIV视网膜病的主要原因。血-视网膜屏障(Blood retinal barrier, BRB)是血眼屏障的重要组成部分,它是存在于视网膜神经组织与血液之间的具有选择通透性的组织结构。正常情况下血-视网膜屏障保护着视网膜组织,使视网膜组织不受病原微生物的侵袭。那么HIV是如何侵入人血-视网膜屏障,从而导致视网膜并发症的呢?HIV具有神经嗜性,神经系统是HIV的病毒储藏库之一。现有治疗手段完全清除HIV感染者体内的病毒是非常困难的,一旦HAART治疗停药,即使是极少数的潜伏感染细胞也可能会导致复发,病毒重新启动复制进而使HIV感染者加速进入艾滋病发病期,这种情况与肿瘤复发较为相似。视网膜作为神经系统的一部分,其内层的神经节细胞(Ganglion cell, GC)、穆勒胶质细胞(Muller glial cell, MGC)可支持HIV的复制,被认为致使视网膜成为HIV的储藏库。因此深入探索HIV如何进入血-视网膜屏障,对于了解HIV如何建立视神经的潜伏感染具有积极的意义。血-视网膜屏障由外屏障和内屏障两部分构成,其中外屏障主要是由视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium, RPE)以及相邻细胞间紧密连接(Tight junctions, TJs)组成。本课题以常用的视网膜色素上皮细胞株D407为研究对象,建立体外血-视网膜外屏障模型,观察HIV对D407细胞的活性、紧密连接蛋白的表达及功能、血-视网膜外屏障的通透性的影响,探讨病毒包膜蛋白gp120在HIV-1影响视网膜色素上皮细胞屏障功能中的作用,并进一步从细胞炎症因子的角度探索HIV入侵血-视网膜外屏障的可能机制,最后探讨HIV-1透过D407细胞层感染靶细胞的作用及与细菌的共感染作用。目的：在体外使用D407细胞系构建血-视网膜外屏障模型,观察不同受体嗜性的HIV-1病毒株对视网膜色素上皮细胞屏障功能的影响,进一步利用包含包膜蛋白的HIV-1假病毒以及HIVJR-FL gp120探讨gp120在HIV-1影响视网膜色素上皮细胞屏障功能中的作用,分析细胞炎症因子在此过程中所起到的作用,从而初步揭示HIV-1进入血-视网膜外屏障的途径,最后探讨HIV-1透过D407细胞层感染靶细胞的作用及与细菌的共感染作用。本研究为HIV视网膜病的发病机制以及临床防治提供基础实验依据。方法：1.感染性克隆病毒和假病毒的制备以及病毒颗粒的浓缩纯化(1)将表达NL4-3(X4受体嗜性)病毒全长基因的质粒,92th014.12(R5受体嗜性)病毒全长基因的质粒分别转染至293T细胞中制备感染性克隆病毒。将pNL4-3.1uc.R-E-和pJR-FL双质粒,pNL4-3.luc.R-E-和pHXB2双质粒分别转染至293T细胞制备假病毒。(2)利用慢病毒浓缩试剂盒纯化转染后的病毒液,一方面可以提高病毒滴度,另一方面可以排除病毒液中炎症因子和其他介质对实验体系的影响。2.血-视网膜外屏障模型的建立将生长至对数期的D407细胞接种于聚酯(PET)膜Transwell透明嵌套上(Corning公司,嵌套膜生长面积4.67cm2,膜孔径0.4μm),上室加入1.5ml细胞悬液,下室加入2.6ml DMEM培养基,隔天换液直至第6天。每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况并用Millicell ERS-2电阻系统测量跨上皮电阻值,当观察到细胞形成完整致密的单细胞层并且电阻值连续两天稳定在120±3Ω·cm2时,可认为D407细胞屏障模型成功建立。3.MTT法检测HIV-1对D407细胞活性的影响将D407细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中,长至单层后用R5嗜性或X4嗜性的HIV-1原液单独处理24-72h,然后用MTT法检测细胞活性,检测病毒颗粒对D407细胞活力的影响。4.HIV-1对D407细胞跨上皮电阻值(Transepithelial electrical resistance, TER)的影响D407细胞屏障模型建立后,分别用不同嗜性的HIV-1颗粒或HIVJR-FL gp120蛋白处理D407细胞,在不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h)用Millicell ERS-2电阻系统测量TER值。5.HIV-1对D407细胞荧光素钠渗漏比率的影响D407细胞屏障模型建立后,用R5嗜性或X4嗜性的感染性克隆病毒分别处理D407细胞24h,然后弃去Transwell上室培养基,加入新鲜配制的荧光素钠溶液(25μg/ml),于0.5h、1h、1.5h、2h分别从Transwell的下室中取出100μl培养基,立即用多功能酶标仪(Tecan)测量荧光值(激发波长：485nm；发射波长：535nm)。6.HIV-1对D407细胞紧密连接蛋白表达的影响(1)定量RT-PCR法：参考文献或使用Primer premier5.0软件设计紧密连接蛋白基因的引物序列(包括ZO-1、Occludin、Claudin-1、Claudin-2、Claudin-3、 Claudin-4、Claudin-5、Claudin-6、Claudin-7和内参基因GAPDH)。用不同嗜性的HIV-1颗粒或HIVJR-FL gp120蛋白分别处理D407细胞24h后,用Trizol提取细胞总RNA,然后逆转录合成cDNA第一链,进行荧光定量PCR实验,用2-△△CT法计算各基因的相对表达量。(2) Western Blotting:用不同嗜性的HIV-1颗粒或HIVJR-FL gp120蛋白分别处理D407细胞48h,提取细胞总蛋白,检测细胞紧密连接蛋白的表达。(3)细胞免疫荧光法：用R5嗜性或X4嗜性的感染性克隆病毒分别处理D407细胞48h,4%多聚甲醛固定细胞,BSA封闭,分别室温孵育Occludin抗体(4μg/ml)或ZO-1抗体(2.5μg/ml)2h,然后加入Goat anti-rabbit IgG-FITC(1：200),避光室温孵育1h, DAPI染色10min,置于荧光显微镜下分别观察Occludin和ZO-1在细胞中的分布。7.检测HIV-1透过D407单细胞层的量随时间变化的规律D407细胞屏障模型建立后,将不同嗜性的HIV-1颗粒分别加入到Transwell的上室中,在不同时间点(2h、4h、6h、8h、12h、24h)于Transwell下室中取样,与等量的5%Triton X-100混合,4℃过夜,ELISA测定下室中p24抗原含量,计算HIV-1的透过率。8.检测HIV-1透过D407单细胞层后对下室CD4+细胞的感染力在Transwell的下室中铺CD4+细胞,分别为TZM-B1(R5嗜性病毒、X4嗜性病毒的靶细胞)、U87.CD4.CCR5(pseudo-HIVJR-FL的靶细胞)、U87.CD4.CXCR4(pseudo-HIVHXB2的靶细胞),密度为3×104个/孔。第二天在上室中加入不同嗜性的HIV-1颗粒后分别继续培养6、12、24h,然后弃去Transwell小室及上室培养基,72小时后统一用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测化学发光。9. ELISA法检测HIV-1对D407细胞炎症因子表达的影响D407细胞屏障模型建立后,用不同嗜性的HIV-1颗粒或HIVJR-FL gp120蛋白分别处理D407细胞24h,收集上清液,用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-6、 IL-10、MCP-1/CCL2等炎症因子的表达。10.炎症因子对D407单细胞层屏障功能的影响D407细胞屏障模型建立后,用Recombinant Human IL-6或Recombinant Human MCP-1处理D407细胞24h, Millicell ERS-2电阻系统测定TER,提取细胞总RNA进行荧光定量PCR实验,提取总蛋白进行Western blotting实验。11.HIV-1破坏视网膜色素上皮细胞导致细菌与病毒的共感染D407细胞屏障模型建立后,用R5嗜性或X4嗜性的感染性克隆病毒分别处理24h,第二天加入无致病性的大肠杆菌菌株(ATCC number:25922),在不同时间点(3h、6h、12h)于Transwell下室中取样,将样品涂布于无抗性的固体琼脂板中,培养24h后计算细菌的单克隆个数。12.统计学分析数据分析和作图依据均采用SigmaPlot10.0(数据分析和作图软件),所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析处理。结果：1.CCR5受体嗜性、CXCR4受体嗜性的两种感染性克隆病毒在不影响D407细胞活力的情况下可以下调D407细胞跨细胞电阻值,增加染料荧光素钠的透过比率,在基因和蛋白水平上下调紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1、 Claudin-2、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-5的表达。2.假病毒以及HIVJR-FL gp120同样可以下调D407细胞的跨细胞电阻值和紧密连接蛋白的表达。而缺失包膜蛋白的病毒颗粒却对D407细胞的电阻值及紧密连接蛋白的表达没有影响。3. ELISA结果显示当HIV-1克隆病毒或假病毒处理D407细胞后细胞炎症因子IL-6和MCP-1/CCL2的表达会上升,但是检测不到TNF-a和IL-10的表达。采用同浓度的Recombinant Human IL-6或Recombinant Human MCP-1处理D407细胞可以导致D407细胞TER的下调,荧光定量PCR和Western blot结果显示紧密连接蛋白ZO-1的表达量有所下降。4.感染实验和p24含量测定都显示克隆病毒能透过D407细胞层并感染下层靶细胞,并且HIV-1能协同细菌侵袭透过D407细胞层。结论：HIV-1感染性克隆病毒可以破坏D407细胞间的紧密连接蛋白,导致跨细胞电阻下降,屏障通透性增加,从而影响血-视网膜外屏障的功能,使病毒渗漏侵入视网膜并且仍具有感染力。采用广泛用于HIV-1入胞机制研究的假病毒以及HIVJR-FL gp120处理D407细胞后也可以观察到类似的紧密连接蛋白下调的现象,这进一步说明HIV-1包膜蛋白在其中起到了一定的作用。此外,本研究还发现HIV-1病毒可以诱导D407细胞炎症因子IL-6和MCP-1/CCL2的分泌,而IL-6和MCP-1在体外能下调紧密连接蛋白ZO-1的表达,结果初步说明HIV-1病毒诱导D407细胞分泌IL-6和MCP-1/CCL2可能是其能破坏视网膜色素上皮细胞紧密连接结构的机制之一。HIV-1破坏视网膜色素上皮细胞紧密连接结构能导致细菌的共感染。