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胃癌是全球发病率第五位、死亡率第三位的恶性肿瘤。胃癌的发生涉及多种危险因素,包括幽门螺杆菌感染、年龄、吸烟、饮食、胆汁反流等。胆汁酸是以胆固醇为原料在肝脏中合成的化合物,是胆汁反流的主要成分。胆汁酸在体内不仅参与脂质、葡萄糖、能量代谢的稳态调节,还通过胆汁酸受体介导发挥信号分子作用。TGR5是一种胆汁酸膜受体,属于G蛋白偶联受体家族。胆汁酸刺激后,TGR5通过偶联的G蛋白发挥信号转导作用。新近研究显示,TGR5在多种肿瘤中表达异常,可能参与恶性肿瘤的发生发展。本课题组前期研究证实,TGR5在胃粘膜肠化生组织中高表达,并通过上调肝细胞核因子4α促进CDX2、MUC2等多种肠型标志分子在胃上皮细胞中的表达。在此基础上,本实验将检测TGR5在胃癌组织中的表达水平,并探索TGR5对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为的影响,为深入理解胃癌发生发展机制提供更多实验依据。第一部分TGR5在胃癌组织中的表达及临床意义目的:探讨TGR5在胃癌组织中的表达及临床意义。方法:利用免疫组织化学染色方法,在含有105对胃癌及癌旁组织的芯片中检测TGR5表达情况。并探讨TGR5表达水平与胃癌患者临床病理参数及生存期的关系。结果:1.TGR5在胃上皮细胞的胞质和胞膜中表达。2.TGR5在胃癌及癌旁组织中均有表达。105例胃癌组织中有43例高表达TGR5,而癌旁组织中仅有10例高表达TGR5,两组差异有统计学意义(P<0.008)。20例伴肠化生癌旁组织中有10例高表达TGR5,而85例不伴肠化生的癌旁组织中未发现TGR5高表达,两组差异有统计学意义(P<0.001)。3.TGR5高表达率在不同肿瘤大小之间存在差异(P=0.018),而与性别、年龄、病理分级、TNM分期、远处转移等无关(P>0.05)。TGR5表达与胃癌患者预后无关。结论:TGR5在胃癌组织中的高表达率显著高于癌旁组织,并且TGR5高表达率随肿瘤体积增大而增强。第二部分TGR5对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响目的:探讨TGR5对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:TGR5特异性小分子干扰RNA处理胃癌AGS、MKN-45细胞后构建TGR5敲减细胞系,慢病毒载体转染胃癌SGC-7901细胞构建TGR5过表达细胞系。借助CCK-8实验、克隆形成实验检测TGR5对细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测TGR5对细胞周期及凋亡的影响,Tanswell实验检测TGR5对胃癌细胞迁移及侵袭的影响。裸鼠成瘤实验检测胃癌细胞的体内生长能力。Western blot检测EMT相关分子β-连环蛋白(β-catenin)、锌脂蛋白转录因子(Snail)、ZEB1在AGS、MKN-45及SGC-7901胃癌细胞中的表达。结果:1.TGR5在正常人胃上皮永生化细胞株GES-1及各胃癌细胞系中均有表达。2.TGR5促进胃癌细胞的体内外生长TGR5敲减导致胃癌AGS和MKN-45细胞增殖能力减弱,而过表达TGR5则显著增强了胃癌SGC-7901细胞的增殖能力。在裸鼠中,LV-TGR5组移植瘤的大小、体积及Ki-67染色强度明显高于对照组。3.TGR5抑制胃癌细胞凋亡但不影响细胞周期分布在AGS及MKN-45细胞中,敲低TGR5后细胞凋亡率均明显升高。TGR5过表达后显著降低胃癌SGC-7901细胞的凋亡率。在AGS、MKN-45及SGC-7901细胞中敲低或过表达TGR5对G0/G1、G2及S期细胞分布无影响。4.TGR5促进胃癌细胞迁移及侵袭侵袭及迁移实验表明,TGR5敲低后从小室穿出的AGS及MKN-45细胞数量较对照组减少;相反,TGR5过表达后从小室穿出的SGC-7901细胞数量显著增多。上调TGR5表达后,SGC-7901细胞中β-catenin、Snail、ZEB1蛋白表达升高。敲低TGR5表达后,AGS细胞中β-catenin、Snail、ZEB1表达降低。结论:TGR5介导胃癌细胞增殖及迁移能力的增强,并抑制细胞凋亡。TGR5可能通过调控EMT途径参与胃癌细胞转移。